海帶提取物對(duì)密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的抑菌作用研究.pdf

1、馬鈴薯環(huán)腐病是嚴(yán)重危害馬鈴薯的病害之一,目前已經(jīng)遍及了幾乎所有的馬鈴薯產(chǎn)區(qū)。引起馬鈴薯環(huán)腐病的病原菌為密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種(Clavibater michiganense subsp. sepedonicum(Spieckermann & Kotthoff)Davis et al.)。當(dāng)前,人們主要利用化學(xué)殺菌劑對(duì)此病進(jìn)行藥物防治。由于化學(xué)殺菌劑本身固有的缺點(diǎn),使其產(chǎn)生了環(huán)境污染、人畜中毒和農(nóng)藥殘留等問(wèn)題。植物在天然環(huán)境中可以形成大量

2、的次生代謝產(chǎn)物來(lái)抵御植物病原菌。因此,以植物為材料的植物源殺菌劑受到了科研工作者們的廣泛關(guān)注。然而,目前仍然沒(méi)有有效抑制密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的植物源殺菌劑出現(xiàn)。本文以海帶為主要材料研究其對(duì)密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的抑菌作用,主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.抑菌植物的篩選和海帶抑菌物質(zhì)提取工藝的優(yōu)化
　　30種植物的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海帶提取物相對(duì)于其他植物提取物具有最好且差異顯著(P<0.05)的抑菌效果。通過(guò)八種溶劑的篩

3、選,得到乙醇為海帶抑菌物質(zhì)提取的有效溶劑。分別進(jìn)行提取溫度、提取時(shí)間和提取比例三個(gè)因素的單因素實(shí)驗(yàn)。由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出了正交實(shí)驗(yàn)因素的水平為,提取溫度70°C、80°C、90°C;提取時(shí)間8h、10h、12h;提取比例1:20、1:25、1:30。正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明提取溫度、提取溫度與提取時(shí)間的交互作用顯著(P<0.05)地影響海帶乙醇提取物對(duì)密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的抑菌效果。海帶抑菌物質(zhì)的優(yōu)化提取工藝為提取溫度80°C、提取時(shí)間12

4、h、提取比例1:25(g:mL)。
　　2.海帶乙醇提取物的性質(zhì)測(cè)定
　　海帶乙醇提取物對(duì)密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的最低抑菌濃度為0.38mg/mL,最低殺菌濃度為0.75mg/mL。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在pH為5時(shí),海帶乙醇提取物具有最好且差異顯著(P<0.05)的抑菌效果。提取物在紫外光下的抑菌活性穩(wěn)定。Mn2+、Ba2+、Zn2+、Fe3+可增強(qiáng)提取物的抑菌活性,Ca2+可降低提取物的抑菌活性。
　　3.海帶抑菌成

5、分的活性追蹤和分析
　　萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,海帶乙醇提取液的石油醚萃取物對(duì)密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種有最強(qiáng)且差異顯著(P<0.05)的抑菌效果。根據(jù)薄層層析(TLC)對(duì)海帶石油醚萃取物的分離結(jié)果,得出石油醚/乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)為柱層析的洗脫液。海帶石油醚萃取物經(jīng)過(guò)一級(jí)柱層析分離后,共得到19個(gè)流份。抑菌結(jié)果表明這19個(gè)流份均對(duì)密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種有抑菌效果,其中流份3(Fr.3)與其他流份及石油醚萃取物相比,抑菌效果最好且有顯著性差異(

6、P<0.05)。二級(jí)柱層析結(jié)果表明,各次級(jí)流份的抑菌效果均顯著(P<0.05)低于 Fr.3的抑菌效果。因此對(duì)一級(jí)柱層析中分離得到抑菌效果最好的Fr.3進(jìn)行進(jìn)一步的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析。結(jié)果得出Fr.3共計(jì)確認(rèn)出了26種化合物,可以分為6類(lèi),其中包括11種烷烴類(lèi)化合物、5種酯類(lèi)化合物、5種有機(jī)酸類(lèi)化合物、3種醇類(lèi)化合物、1種酚類(lèi)化合物和1種酸酐類(lèi)化合物。所有組分中相對(duì)含量較高(4％)的有9種化合物,分別為:二十五烷(11

7、.97%)、二十七烷(10.71%)、三十四烷(10.22%)、三十一烷(10.07%)、二十九烷(9.68%)、二十八烷(7.57%)、三十六烷(7.32%)、四十四烷(5.88%)和二十二烷(4.04%)。
　　4.海帶抑菌成分作用機(jī)理的研究
　　設(shè)計(jì)了生長(zhǎng)曲線測(cè)定實(shí)驗(yàn)、掃描電子顯微鏡(SEM)觀察實(shí)驗(yàn)、透射電子顯微鏡(TEM)觀察實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜透性實(shí)驗(yàn)、菌體內(nèi)活性氧(ROS)水平,超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化

8、氫酶(CAT)活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)、呼吸代謝影響實(shí)驗(yàn)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳實(shí)驗(yàn)、核酸影響實(shí)驗(yàn)。通過(guò)這八類(lèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)Fr.3作用于密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的抑菌機(jī)理進(jìn)行了探討。生長(zhǎng)曲線的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Fr.3主要作用于密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的對(duì)數(shù)期,通過(guò)抑制菌體的正常分裂來(lái)抑制菌體生長(zhǎng)。采用掃描電鏡和透射電鏡觀察密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的超微結(jié)構(gòu),Fr.3作用后的密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種細(xì)胞壁損壞、細(xì)胞膜破損、細(xì)胞出現(xiàn)了腫脹、結(jié)團(tuán)、

9、質(zhì)壁分離的現(xiàn)象,菌體內(nèi)部出現(xiàn)了大小不一的空腔,一些受破壞嚴(yán)重的菌體被裂解成片狀。分別檢測(cè)菌體外堿性磷酸酶(AKP)活性和OD260nm值得出Fr.3對(duì)密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜有破壞作用。流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡的檢測(cè)結(jié)果表明Fr.3作用后的菌體,細(xì)胞膜出現(xiàn)了嚴(yán)重的去極化現(xiàn)象,菌體內(nèi)Ca2+濃度有所上升。這個(gè)結(jié)果也證明了Fr.3作用下的密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的細(xì)胞膜受到了破壞。熒光分光光度計(jì)和紫外分光光度計(jì)的檢測(cè)結(jié)果得出Fr.

10、3能夠使菌體內(nèi)ROS顯著性地積累、SOD和CAT活性降低。通過(guò)進(jìn)行培養(yǎng)基溶氧測(cè)定實(shí)驗(yàn)、呼吸抑制率及疊加率測(cè)定實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)和總ATP酶(T-ATPase)活性測(cè)定實(shí)驗(yàn),得出Fr.3通過(guò)抑制LDH、MDH和SDH活性來(lái)抑制糖酵解(EMP)途徑和三羧酸(TCA)循環(huán),使得呼吸作用減弱。SDS-PAGE的結(jié)果顯示,Fr.3作用后菌體的總蛋白

11、量不斷減少。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果得出 Fr.3能夠明顯地減少菌體內(nèi)DNA和RNA的含量。瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Fr.3可以直接作用于密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的基因組DNA。Fr.3作用后,基因組 DNA的紫外光譜發(fā)生了明顯的增色效應(yīng),說(shuō)明由于Fr.3的作用,導(dǎo)致了DNA雙螺旋的結(jié)構(gòu)受到了破壞。Fr.3和溴化乙錠(EB)與基因組DNA的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Fr.3和EB競(jìng)爭(zhēng)性地插入到 DNA雙螺旋的堿基對(duì)中,使得 EB-DNA復(fù)合物的

12、數(shù)量減少。流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果表明由于 Fr.3的作用,使得密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種正常的細(xì)胞分裂周期發(fā)生了紊亂,細(xì)菌數(shù)目減少。總之,Fr.3中的抑菌物質(zhì)通過(guò)不同位點(diǎn)的協(xié)同作用最終導(dǎo)致密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的死亡。
　　5.海帶乳油的配制和活體抑菌效果
　　海帶乳油的配方為:提取物浸膏(20%)、乙醇(10%)、吐溫-80(4%)及水(66%)。海帶乳油具有良好的穩(wěn)定性和分散性?；铙w實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,海帶乳油有較好的預(yù)防效果和治療

13、效果,說(shuō)明海帶乳油可以很好地防治密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種對(duì)馬鈴薯的侵染。
　　6.其他植物對(duì)密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的抑菌效果
　　在所篩選的30種植物中,紅蓼提取物和中華蹄蓋蕨提取物的抑菌效果雖然略低于海帶,卻顯著性(P<0.05)地高于其他植物提取物的抑菌效果。以紅蓼和中華蹄蓋蕨作為殺菌植物資源抑制密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種,國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道。本文對(duì)紅蓼葉和中華蹄蓋蕨抑菌物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,紅蓼葉抑菌物質(zhì)的優(yōu)化提取工藝為提

14、取時(shí)間6h、提取溫度80°C、提取比例1:10(g:mL)。中華蹄蓋蕨抑菌物質(zhì)的優(yōu)化提取工藝為提取比例1:20(g:mL)、提取溫度97°C、提取時(shí)間10h。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在pH為5時(shí),紅蓼葉乙醇提取物具有最好且差異顯著(P<0.05)的抑菌效果。在pH為2時(shí),中華蹄蓋蕨乙醇提取物具有最好且差異顯著(P<0.05)的抑菌效果。紅蓼葉和中華蹄蓋蕨乙醇提取物在紫外光下的抑菌效果穩(wěn)定。Zn2+、Fe3+可以增強(qiáng)紅蓼葉和中華蹄蓋蕨乙醇提取