褐藻膠裂解酶分泌菌株的分離鑒定及Tamlana holothuriorum s12T中褐藻膠裂解酶的研究.pdf

1、褐藻作為第三代可持續(xù)發(fā)展生物燃料的原料之一，其繁殖快、耗能低、不占用耕地和不消耗淡水，不產(chǎn)生糧食矛盾，與以谷物為代表的第一代生物能源原料和以秸稈等為代表的第二代生物能源原料相比，具有廣闊的應用前景。盡管已有研究表明利用褐藻進行生物轉化如發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇是切實可行的，但由褐藻生產(chǎn)生物乙醇的全部潛力還難以實現(xiàn)，其主要問題是工業(yè)微生物菌株難以有效地降解褐藻膠中L-古羅糖醛酸片段、D-甘露糖醛酸片段及其嵌合片段生成可被工業(yè)菌株吸收并利用的單糖，

2、且降解產(chǎn)生的糖醛酸單體化合物也難以被轉化利用。褐藻膠降解酶屬于多糖裂解酶，多為聚D-甘露糖醛酸底物特異性的內(nèi)切型褐藻膠裂解酶，降解產(chǎn)物為寡糖;而能夠同時降解L-古羅糖醛酸片段、D-甘露糖醛酸片段及其嵌合片段的多功能酶較少，特別是缺乏廣泛底物特異性的外切酶。因此，尋求新型高效且具有廣泛底物特異性的褐藻膠裂解酶及酶系是褐藻膠生物轉化生產(chǎn)所面臨的重要任務。
　　本項研究旨在篩選新型高效褐藻膠裂解酶分泌菌株，研究其產(chǎn)酶特性，并外源表征新型

3、或高效褐藻膠裂解酶的基因，初步闡述高效褐藻膠降解菌的降解機制，為深入研究褐藻生物質(zhì)降解轉化機制積累基礎數(shù)據(jù)，為褐藻膠的生物轉化提供優(yōu)良的菌種資源、酶制劑奠定生物學基礎。在本項研究中取得的主要成果如下:
　　一、對近海和陸地環(huán)境樣品進行了褐藻膠裂解酶分泌菌株的廣泛篩選，獲得了多個新物種和多株高效褐藻膠降解菌。
　　從十余種環(huán)境樣品中分離獲得182株褐藻膠裂解酶分泌菌株，這些菌株分布在52個屬。發(fā)現(xiàn)其中22個屬的細菌尚未見報道具

4、有分泌褐藻膠裂解酶的功能。
　　以16S rRNA相似度閾值98.7％為判斷細菌新物種的標準，發(fā)現(xiàn)在所篩選的褐藻膠降解菌株中有13株為潛在新物種。4株細菌的16S rRNA最高相似度低于97％，新穎性好，其中3株海洋細菌屬于擬桿菌門（菌株Dm15T和Gy8T屬于擬桿菌門黃桿菌科，菌株Sy30T屬于擬桿菌門嗜纖維菌科）。此外，篩選到的一株酶活高且傳代穩(wěn)定的褐藻膠降解菌為來自海參腸道的菌株s12T，與Tamlanaagarivoran

5、s JW-26T最高相似度為99.1％，也屬于擬桿菌門黃桿菌科。
　　經(jīng)多相分類學研究，對分離到的擬桿菌門4個新菌進行了鑒定。高效褐藻膠降解菌株s12T為黃桿菌科Tamlana屬的新種，命名為Tamlana holothuriorum sp.nov.;菌株Dm15T為黃桿菌科的新屬新種，命名為Flavohalobacter algicola gen.nov.sp.nov.;菌株Gy8T為黃桿菌科Seonamhaeicola屬的新種

6、，命名為Seonamhaeicola algicola sp.nov.;菌株Sy30T為擬桿菌門Hymenobacter科Pontibacter屬的新種，命名為Pontibacter locisalis sp.nov.。
　　二、完成了褐藻膠高效降解菌株s12T的基因組測序及分析，發(fā)現(xiàn)該菌具有新穎的褐藻膠降解酶和較完整的褐藻膠代謝途徑。
　　對菌株s12T進行了基因組測序及序列分析。菌株s12T基因組全長3.66 Mbp，共

7、有3151個編碼蛋白基因，其中1,729個蛋白可以匹配到同源蛋白聚簇數(shù)據(jù)庫，其它大量功能未知的基因序列預示著該菌的新功能和新基因存在的可能。通過對基因組數(shù)據(jù)的生物信息分析，預測到該菌共有11條編碼褐藻膠裂解酶基因（alg1-11），與數(shù)據(jù)庫中已表征的褐藻膠裂解酶序列的相似度均低于73％，其中包括2個外切型褐藻膠裂解酶基因alg5和alg9。對所預測的這些酶的氨基酸序列進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)Alg9屬于多糖解酶（Polysaccharide

8、 Lyase，PL）17家族，其它10個褐藻膠裂解酶則均屬于PL7家族，其中Alg1屬于PL7第3亞家族，Alg2和Alg5屬于PL7第5亞家族，Alg4、Alg6-8、Alg10、Alg11所屬亞家族待定。Alg2、Alg5、Alg6和Alg9與其同源性高的褐藻膠裂解酶均具有保守的催化氨基酸殘基，而Alg1、Alg3、Alg4、Alg7、Alg8、Alg10和Alg11對于催化位點關鍵氨基酸保守性差，說明后者可能具有新的催化特性。Al

9、g1-4、Alg7、Alg9和Alg11除了催化結構域外，還包含碳水化合物結合域、C端凝血因子結構域、凝集素結構域、信號肽、分泌系統(tǒng)、細菌免疫球蛋白樣和類肝素酶結構域，根據(jù)結構域功能預測至少上述具有多個結構域的7個褐藻膠裂解酶為分泌性蛋白?？傊镄畔W分析顯示菌株s12T中的褐藻膠裂解酶（酶系）具有多樣性和新穎性。
　　根據(jù)生物信息分析，同時預測出菌株s12T具有較完整的褐藻膠代謝途徑。分析顯示褐藻膠在胞外可被內(nèi)切型和外切型褐

10、藻膠裂解酶降解為雙糖或不飽和單糖，自動形成開環(huán)單體4-脫氧-L-赤蘚-糖醛酸后被吸收進入胞內(nèi)，由還原酶催化生成2-酮-3-脫氧葡糖酸，進入Entner-Doudoroff途徑生成三磷酸甘油醛和丙酮酸，三磷酸甘油醛通過糖酵解代謝途徑轉化為丙酮酸。然后，丙酮酸通過丙酮酸脫氫酶轉化為乙酰輔酶A，進入三羧酸循環(huán)或乳酸發(fā)酵，完成褐藻膠的轉化或徹底降解。
　　三、完成了菌株s12T的褐藻膠產(chǎn)酶特性和胞外蛋白組的測定分析，發(fā)現(xiàn)注釋的11個褐藻膠

11、裂解酶均為胞外蛋白，且蔗糖對褐藻膠裂解酶的表達具有誘導作用。
　　菌株s12T可以在褐藻膠為唯一碳源的基礎培養(yǎng)基中生長，添加EDTA、SDS和其它金屬離子如MnSO4、CaCl2、CuSO4和ZnSO4后均顯著抑制總酶活和總蛋白量;Na2CO3、NiSO4、KCl、納米SiO2、納米TiO2和納米Al3O4對產(chǎn)酶效應影響不顯著。添加外源糖類時，果糖、麥芽糖和淀粉均降低該菌的產(chǎn)酶活性;葡萄糖的存在對產(chǎn)酶影響不顯著，而較為特殊的是，蔗

12、糖不能被該菌利用，不阻遏褐藻膠裂解酶的產(chǎn)生，反而能夠顯著提高酶的發(fā)酵活性，即蔗糖對該菌褐藻膠裂解酶的產(chǎn)生具有誘導作用。經(jīng)優(yōu)化得到該菌褐藻膠裂解酶的最適產(chǎn)酶條件為:培養(yǎng)溫度28℃，氮源為0.5％NaNO3,初始pH值為7.5-8.0，褐藻膠初始濃度為2-2.5％，添加0.2％蔗糖。在該培養(yǎng)條件下，菌株s12T不利用培養(yǎng)基中的蔗糖，培養(yǎng)28 h后達到生長平臺期，培養(yǎng)36h后達到最高總酶活44.3 U/mL，44h內(nèi)可將2.0％海藻酸鈉完全降

13、解至產(chǎn)物中檢測不出單糖。
　　通過胞外蛋白組分析，發(fā)現(xiàn)菌株s12T基因組中所注釋的9個褐藻膠裂解酶Alg1-4和Alg7-11為胞外蛋白，蔗糖的存在可以顯著增加Alg1和Alg7的分泌量，從而提高菌株s12T褐藻膠裂解酶的總酶活。蔗糖促進微生物褐藻膠裂解酶的分泌和提高酶活的作用尚未見相關報道。
　　四、外源表達了4個褐藻膠裂解酶基因，表征了酶活較高的內(nèi)切型裂解酶rAlg2和外切型裂解酶rAlg5的酶學性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該菌的褐藻膠裂

14、解酶具有廣泛的底物特異性。
　　根據(jù)前期預測，將菌株s12T中片段較小的褐藻膠裂解酶基因alg1、alg2、alg5和alg6在大腸桿菌中進行外源表達，并對酶活較高的rAlg2和rAlg5進行了酶學性質(zhì)的表征。研究發(fā)現(xiàn)重組酶rAlg2降解產(chǎn)物為2、3和4糖，故重組酶rAlg2為內(nèi)切酶;重組酶rAlg5的降解產(chǎn)物中有單糖，故重組酶rAlg5為外切酶。重組酶rAlg2和rAlg5的最適反應溫度均為40-45℃，溫度穩(wěn)定范圍分別為4-4

15、0℃和4-20℃;兩者的最適反應pH值分別為6.0-6.5和7.0-8.0，pH穩(wěn)定范圍為6.0-7.0和7.0-8.0。研究發(fā)現(xiàn)KCl和NaCl能顯著提高重組酶rAlg2的酶活，而對重組酶rAlg5酶活影響不顯著;SDS、EDTA、NH4Cl、FeCl3、FeSO4、MnCl2、CaCl2和MgCl2顯著抑制重組酶rAlg2和rAlg5的酶活。結果顯示重組酶rAlg2和rAlg5都具有廣泛的底物特異性，底物偏好性分別為聚L-古羅糖醛酸

16、片段和聚D-甘露糖醛酸片段。在以海藻酸鈉為底物時，重組酶rAlg2和rAlg5的比酶活分別為2350和1350 U/mg，Km分別為0.03和0.20 mM，Kcat分別為13.4和4.4 S-1,Kcat/Km分別為45.4和220.5 S-1mM-1。
　　褐藻膠裂解酶Alg5是在PL7家族發(fā)現(xiàn)的第二個外切酶，有獨特的特點。經(jīng)氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)Alg5和來自菌株Zobellia galactanivorans DsiJT的A

17、lyA5同源性最高，在催化腔內(nèi)具有保守的關鍵氨基酸。功能表征發(fā)現(xiàn)兩者均為廣泛底物特異性的外切酶，但兩者底物偏好性不同，據(jù)報道AlyA5偏好聚L-古羅糖醛酸，而本實驗中重組酶rAlg5偏好聚D-甘露糖醛酸。這也說明重組酶rAlg5的底物識別與催化腔內(nèi)保守氨基酸關系不大，可能與圍繞在催化腔周圍的loop構象或其非保守的氨基酸有關。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)重組酶rAlg5在低溫4℃下其酶活可達到最高酶活時的51.2％，熱穩(wěn)定性差，生理系數(shù)Kcat/