海洋弧菌QY103褐藻膠裂解酶的研究.pdf

1、褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古羅糖醛酸兩種糖單元通過(guò)1，4糖苷鍵聚合而成的線性大分子，主要存在于海帶、馬尾藻、巨藻等褐藻的細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)。另外，假單胞菌屬、固氮菌屬等細(xì)菌也可以產(chǎn)生胞外褐藻膠，但在β-D-甘露糖醛酸的2位或3位上發(fā)生O-乙?；?。銅綠假單胞菌是臨床最常見(jiàn)的條件致病菌之一，它產(chǎn)生的乙?；衷迥z決定其生物膜(biofilm)的結(jié)構(gòu)和功能；一旦形成生物膜，銅綠假單胞菌將具有極強(qiáng)的抗生素耐藥性(比浮游細(xì)菌高100-10

2、00倍)和逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊的能力，導(dǎo)致臨床上持續(xù)性、難治性感染。因此，乙?；衷迥z是銅綠假單胞菌重要的致病因子。 褐藻膠裂解酶能通過(guò)β-消去反應(yīng)裂解褐藻膠的1，4糖苷鍵，在非還原性末端生成帶有C4，5雙鍵的不飽和糖醛酸。褐藻膠裂解酶在褐藻膠寡糖制備、防治銅綠假單胞菌感染、海藻研究等方面具有巨大應(yīng)用前景，尤其在防治銅綠假單胞菌感染方面可能為解決細(xì)菌的耐藥性開(kāi)辟新途徑。但目前所發(fā)現(xiàn)的褐藻膠裂解酶只有少數(shù)幾種可以降解細(xì)菌產(chǎn)生的乙

3、?；衷迥z，且比活力低，受人體中各種離子(如Ca2+、Zn2+)的抑制作用較大，所以難以用于臨床治療。因此，高活力、高特異性的褐藻膠裂解酶的發(fā)現(xiàn)就成為研究的熱點(diǎn)。 本文利用以褐藻膠為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，從青島近海篩選到褐藻膠裂解酶產(chǎn)量較高的菌株32株，其中菌株QY103酶活力最高，對(duì)褐藻膠和乙?；衷迥z的酶活分別達(dá)到5.87 U/mL和4.22 U/mL。通過(guò)形態(tài)觀察、生理與生化特征測(cè)定、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，將菌株QYl03鑒

4、定為弧菌屬細(xì)菌。 經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化，得到弧菌QY103最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方(％，w/v)：褐藻酸鈉0.5，NH4NO3 0.2，KH2PO4 0.4，K2HPO4 0.6，NaCl 3.0，MgSO4 0.01，F(xiàn)eSO4 0.01，pH 5.5。最佳發(fā)酵條件為：按3％(v/v)接種量接種培養(yǎng)基，28℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)72h。優(yōu)化后，QYl03到達(dá)產(chǎn)酶高峰的時(shí)間由4天縮短到3天，褐藻膠裂解酶最高產(chǎn)量由5.87 U/mL提

5、高到45.26 U/mL，增加了6.71倍。 利用硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析從弧菌QY103發(fā)酵液上清中純化到一種新褐藻膠裂解酶，純化15.13倍，得率為29.81％。SDS-PAGE表明達(dá)到電泳純，分子量為35.6 kDa，命名為AlyVII。褐藻膠裂解酶AlyVII的比活力為1863.45 U/mg，最適溫度40℃，在30℃下穩(wěn)定；最適pH 6.0，在pH 5-9之間比較穩(wěn)定；Na+、K+、Mg2+、Ca2

6、+、Zn2+、Ba2+、EDTA能促進(jìn)酶活性，而Mn2+、Ni2+、Fe2+、SDS能抑制酶活性。褐藻膠裂解酶AlyrVII能降解各種來(lái)源(包括褐藻和銅綠假單胞菌)的褐藻膠，對(duì)褐藻來(lái)源的褐藻膠和poly(M)片段降解能力更強(qiáng)。 利用96孔板模型和flow cell模型檢測(cè)了褐藻膠裂解酶AlyVII對(duì)7株銅綠假單胞菌菌株生物膜形成的抑制作用和對(duì)已形成生物膜的清除作用。AlyVII對(duì)其中6株具有抗生物膜作用，總有效率達(dá)到85.7％

7、。50 μg/mL AIyVII即對(duì)4株菌株生物膜形成的抑制率超過(guò)80％，對(duì)6株菌株生物膜的清除率為35.28％-65.77％。100 μg/mL AIyVII則對(duì)5株菌株生物膜形成的抑制率和對(duì)已形成生物膜的清除率均超過(guò)80％。褐藻膠裂解酶AIyVII與慶大霉素聯(lián)合使用，能提高慶大霉素對(duì)其中6株菌株生物膜內(nèi)細(xì)菌的殺滅能力，使其MBEC降低16-64倍。褐藻膠裂解酶AlyVII對(duì)銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)略有促進(jìn)作用。 以上結(jié)果表明，