海洋細(xì)菌褐藻膠裂解酶在大腸桿菌中表達(dá)，加工與轉(zhuǎn)運(yùn)及重組酶的純化與性質(zhì)研究.pdf

1、本文研究了海洋細(xì)菌褐藻膠裂解酶在大腸桿菌中表達(dá)，加工與轉(zhuǎn)運(yùn)及重組酶的純化與性質(zhì)。 首先，從原始菌株中純化褐藻裂解酶，用以免疫小鼠制備抗褐藻膠裂解酶多克隆抗體。經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)為1/128，可以完全特異性地識(shí)別褐藻膠裂解酶。 成功地將alyPEEC基因及編碼成熟蛋白區(qū)域的基因序列克隆到阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)載體pBAD24上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBAD-ALY和pBAD-csALY，在大腸桿菌TOP10中通過阿

2、拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表明TOP10/pBAD-csALY在誘導(dǎo)表達(dá)后沒有褐藻膠裂解酶活性，TOP10/pBAD-ALY誘導(dǎo)后表達(dá)，且具有活性，酶表達(dá)量是原始菌株的7.5倍，并且海水影響其蛋白表達(dá)及其活性，添加海水比淡水培養(yǎng)基活性高5.8倍。海水影響活性重組褐藻膠裂解酶的產(chǎn)量，海水的組分MgCl<,2>、NaCl、CaSO<,4>能夠提高活性酶的產(chǎn)量。RT-PCR方法檢測(cè)，海水不影響褐藻膠裂解酶基因的mRNA表達(dá)水平，含50％(v/v)海

3、水和不含海水的LB培養(yǎng)基中，褐藻膠裂解酶基因的mRNA表達(dá)水平相等。Westem bloting方法檢測(cè)蛋白表達(dá)，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)軟件分析表明培養(yǎng)基中添加海水能夠促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)或者增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。海水在前體蛋白加工上有重要的影響，添加海水能夠促使蛋白前體加工成有活性的成熟蛋白。另外表達(dá)的重組蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)空間及細(xì)胞外環(huán)境中，而不形成包涵體，從而避免蛋白復(fù)性等許多問題。將重組表達(dá)載體pBAD-ALY轉(zhuǎn)入大腸桿菌MC4100A(w

4、t)CU164A(SecY缺陷型)和BILKOA(Tat缺陷型)中，通過誘導(dǎo)表達(dá)AlyPEEC，研究蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)與加工過程。研究發(fā)現(xiàn)，AlyPEEC在大腸桿菌中通過Sec途徑轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)和培養(yǎng)基中，在細(xì)胞周質(zhì)中的存在兩種分子量的活性蛋白分別是42 kDa和32 kDa。細(xì)胞質(zhì)中仍然存在成熟蛋白，這可能是在跨膜時(shí)，蛋白沒有完全轉(zhuǎn)運(yùn)。 通過分子篩Sephadex G-75柱和離子交換層析DEAE-Sepharose Fast

5、 Flow兩步法純化重組酶。純化的重組褐藻膠裂解酶最適溫度為30℃，是一個(gè)熱不穩(wěn)定酶，在30 ℃時(shí)保溫10 min后，仍保留80％的相對(duì)酶活，而在70℃保溫10 min后完全沒有酶活。該重組酶最適pH值為7.0，在pH.6.0～pH 7.0之間重組的褐藻膠裂解酶比較穩(wěn)定，在低于pH 6.0或高于pH 7.0酶活明顯下降。Na<'+>、K<'+>、Mg<'2+>、Mn<'2+>、Ca<'2+>和Ba<'2+>是重組褐藻膠裂解酶激活劑，而Z

6、n<'2+>，.Ag<'+>和Co<'2+>起到抑制作用。螯合劑EDTA較強(qiáng)地抑制重組褐藻膠裂解酶活性，而螯合劑EGTA和1-10-phenanthroline較溫和地抑制重組褐藻膠裂解酶活性，這說明純化的褐藻膠裂解酶是金屬酶(Ramirez-Zavala et al.2004)。PMSF也微弱地抑制重組褐藻膠裂解酶活性，這說明絲氨酸殘基對(duì)褐藻膠裂解酶的活性中心是必要的(George andDiwan 1983)。該重組褐藻膠裂解酶能夠