元蘑多糖活性部位分析及對60Co-γ輻射損傷的防護(hù)作用.pdf

1、電離輻射通過誘導(dǎo)人體產(chǎn)生過量的ROS,攻擊機(jī)體中的生命物質(zhì),如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類,引發(fā)自由基鏈狀反應(yīng),破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)長期暴露在電離輻射環(huán)境下能夠誘導(dǎo)人體產(chǎn)生各種疾病,如衰老、炎癥、心腦血管疾病,甚至引發(fā)癌癥,篩選出高效低毒的輻射防護(hù)劑成為科研工作者研究的熱點(diǎn)。據(jù)研究報(bào)道多糖能夠通過提升機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的活性,從而發(fā)揮輻射防護(hù)的作用。因此,本論文以食用菌為研究對象,通過在體外建立多重抗氧化模型,從8種食用菌中篩

2、選出抗氧化活性最強(qiáng)的中性元蘑多糖(NTHSP)作為后續(xù)研究目標(biāo);采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化NTHSP提取工藝,并對其進(jìn)行純化和結(jié)構(gòu)表征;系統(tǒng)的研究了NTHSP在體外和體內(nèi)對輻射誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的防護(hù)功效并揭示其輻射防護(hù)作用機(jī)制。
　　采用酸堿度不同的3種溶劑從產(chǎn)自中國不同地區(qū)具有代表性的8種食用菌中分離23種食用菌多糖,成分分析結(jié)果表明食用菌多糖樣品中僅含有少量蛋白質(zhì),無多酚類物質(zhì);通過在體外建立抗氧化模型,研究了食用菌多糖對生理性O(shè)H·自由

3、基、超氧自由基和非生理性ABTS自由基的清除活性、對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用以及鐵離子還原能力,結(jié)果表明NTHSP的抗氧化活性最強(qiáng),選擇其作為后續(xù)研究對象。
　　采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對NTHSP提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳提取條件為:提取溫度94℃、提取時(shí)間3.0h、液料比110:1和超聲功率480W,所得到的多糖提取得率為17.45±0.18％,而通過傳統(tǒng)方法提取NTHSP的得率僅為10.21±0.36%;通過離子交換纖維素DEAE-5

4、2及葡聚糖凝膠層析Sephadex G-100對NTHSP進(jìn)行純化,采用凝膠滲透色譜(GPC)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、紅外光譜(FT-IR)、核磁共振光譜(NMR)和原子力顯微鏡(AFM)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,結(jié)果表明NTHSP為一種具有高分支結(jié)構(gòu)的葡聚糖,分子量為8.09×103,由阿拉伯糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖(3.8:15.8:28.4:10.5)組成,主鏈由→3,6)-α-D-Glcp-(1→組成,其側(cè)鏈→2)-α-L-Arap

5、-(1→、α-D-Manp-(1→和→6)-β-D-Galp-(1→分別連接在→3,6)-α-D-Glcp-(1→的3位、3位和6位上,其中,→2)-α-L-Arap-(1→和→6)-β-D-Galp-(1→的2位和6位分別連接甲基。
　　通過在體外建立輻射誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷模型,研究NTHSP對大鼠外周血白細(xì)胞、大鼠脾細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的輻射防護(hù)作用,通過對輻射后大鼠脾細(xì)胞中SOD和CAT的活性以及MDA的水平進(jìn)行

6、研究,發(fā)現(xiàn)NTHSP能夠顯著提升輻射后大鼠脾細(xì)胞中抗氧化酶SOD和CAT的活性,并降低脾細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生;NTHSP還能夠有效的降低外周血白細(xì)胞中異形淋巴細(xì)胞、帶空泡分葉細(xì)胞和退行性變細(xì)胞的數(shù)量,提升正常白細(xì)胞的數(shù)量,對外周血白細(xì)胞起到有效的防護(hù);通過DNAladder研究NTHSP對輻射后脾細(xì)胞DNA的防護(hù)作用,結(jié)果表明NTHSP對電離輻射誘導(dǎo)脾細(xì)胞DNA凋亡起到顯著的防護(hù)功效,并不同程度的促進(jìn)了脾細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖,顯著的提

7、升輻射后脾細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。
　　通過在體內(nèi)建立輻射誘導(dǎo)小鼠氧化損傷模型,研究NTHSP的輻射防護(hù)途徑,結(jié)果顯示NTHSP能夠有效的提升輻射后小鼠體內(nèi)的抗氧化酶系(SOD、CAT和GSH-Px)的活性和增強(qiáng)抗氧化物質(zhì)(GSH、VE和銅藍(lán)蛋白)的合成能力,并降低小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的水平,表明NTHSP能夠增強(qiáng)輻射后小鼠抗氧化系統(tǒng)的活性;對輻射后小鼠特異性免疫和非特異性免疫進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)NTHSP能夠有效的提升小鼠血液

8、系統(tǒng)免疫能力、增加小鼠免疫器官指數(shù)、促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖并增強(qiáng)單核細(xì)胞的吞噬作用;通過對小鼠骨髓微核、骨髓染色體畸變和DNA含量進(jìn)行分析,結(jié)果顯示NTHSP能夠?qū)椛湔T導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的遺傳毒性起到有效的防護(hù)。
　　通過免疫組織化學(xué)方法和流式細(xì)胞儀檢測脾細(xì)胞周期研究NTHSP的輻射防護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NTHSP能夠有效的抑制電離輻射誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞停滯在G0/G1期,并對電離輻射誘導(dǎo)的脾細(xì)胞凋亡起到防護(hù)功效,從而恢復(fù)細(xì)胞的正常生理代謝

9、過程;通過對細(xì)胞凋亡線粒體途徑相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行分析,研究發(fā)現(xiàn)NTHSP能夠通過抑制促凋亡蛋白Bax、細(xì)胞色素c和Caspase-3活化亞基的表達(dá),促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡,從而對輻射誘導(dǎo)氧化損傷具有防護(hù)功效。
　　本課題研究發(fā)現(xiàn)NTHSP可以降低電離輻射誘導(dǎo)活性氧ROS的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài),提升機(jī)體免疫活性,通過影響線粒體凋亡信號(hào)途徑相關(guān)蛋白表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡,從而對輻射誘導(dǎo)的氧化損傷具有顯著的防護(hù)功