RNA二級結(jié)構(gòu)與RNA干擾效率的構(gòu)效關(guān)系研究.pdf

1、RNA干擾，是最近發(fā)現(xiàn)的一種廣泛存在于生命體中，高度保守的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。長度為21-25 nt的雙鏈小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)以堿基互補配對方式，利用內(nèi)源性RNA干擾機制，高效、特異地降解靶標RNA(mRNA)，從而消除該靶標RNA的功能，例如其調(diào)控作用或其對應蛋白的合成。人體內(nèi)源性RNA干擾途徑的發(fā)現(xiàn)，極大激發(fā)了核酸生物制藥技術(shù)的研究熱度。與傳統(tǒng)小分子藥物及抗體藥物相比，siRN

2、A借助廣譜的RNA干擾機制（更加廣譜的靶標）和快速的一維藥物設(shè)計（針對靶標堿基互補的一級序列），具有預防和治療眾多疾病的潛力，這些性質(zhì)毫無疑問使得RNAi藥物技術(shù)成為較為理想的生物制藥技術(shù)。
　　如此理想的藥物技術(shù)，在成藥性方面仍然面臨著挑戰(zhàn):siRNA血清穩(wěn)定性差，細胞膜通透性差，時有脫靶以及免疫副反應。提高RNA干擾效率（超高效性、選擇性），將有利于降低給藥性難度以及副反應。我們假設(shè):RNA二級結(jié)構(gòu)將會影響RNA血清穩(wěn)定性以及

3、RNA干擾效率;同時，就像傳統(tǒng)的小分子制藥技術(shù)一樣，應該可以利用外源性小分子增效RNA干擾過程。深入理解RNA結(jié)構(gòu)中影響RNA干擾效率的因素，毫無疑問，將加速RNA干擾技術(shù)的成藥進程。本文圍繞如何提高RNA干擾效率（超高效性、選擇性），系統(tǒng)研究了RNA二級結(jié)構(gòu)對RNA干擾效率的構(gòu)效關(guān)系。我們通過化學修飾siRNA，改變其拓撲結(jié)構(gòu)，提高了雙鏈siRNA引導鏈的干擾活性及鏈間選擇性，與此同時，通過化學修飾提高了RNA血清穩(wěn)定性;從而能進一步

4、提高siRNA有效濃度。我們發(fā)現(xiàn)，確實可以找到小分子化合物增效RNA干擾過程，這一研究也促使我們在分子水平上理解特定蛋白因子在RNA干擾通路中的功能。
　　本文具體發(fā)現(xiàn)闡述如下:
　　一、高活性以及高特異性小發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（small hairpin-shaped RNA，shRNA）的設(shè)計合成與活性測試。
　　天然pre-microRNA或者病毒RNA中經(jīng)常出現(xiàn)的stem-loop結(jié)構(gòu)，促使我們思考:為什么這些RNA

5、總是含有確定的loop結(jié)構(gòu)，這些loop結(jié)構(gòu)的具體結(jié)構(gòu)細節(jié)對于這些天然RNA功能的有效實現(xiàn)是否具有指導意義？含有l(wèi)oop結(jié)構(gòu)的shRNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具備有效的RNA干擾功能，但具體會體現(xiàn)到RNA干擾效率的哪幾個方面上？我們深入研究發(fā)現(xiàn):
　　1、與具有完全相同莖干區(qū)域的雙鏈siRNA相比，帶有3'-末端懸垂結(jié)構(gòu)的一類shRNA表現(xiàn)出3'-臂鏈RNA干擾活性顯著增強，同時互補鏈RNA干擾活性極大降低，鏈選擇差異性可達到1000倍;這是首

6、次發(fā)現(xiàn)loop結(jié)構(gòu)的適當存在，能夠極大改善RNA干擾中雙鏈的脫靶效應。這也為經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的天然RNA的功能特異性提供了進一步思考的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　2、改變shRNA5味'端和3'末端的特征結(jié)構(gòu)（包括平末端、5'懸垂結(jié)構(gòu)和3'懸垂結(jié)構(gòu)）以及l(fā)oop的大小，發(fā)現(xiàn)3'末端的懸垂結(jié)構(gòu)與loop結(jié)構(gòu)一道能夠增強3'-臂鏈的RNA干擾活性;這些結(jié)果表明RNA干擾效率所包含的高效性及選擇性，并不是單一因素就可以完全調(diào)控的。如何找到這些結(jié)構(gòu)因素的多因

7、子優(yōu)化配置將會極大影響RNA干擾效率，進一步表明深入研究RNA二級結(jié)構(gòu)對RNA干擾效率的構(gòu)效關(guān)系是極為必要的。
　　3、通過改變莖干區(qū)域堿基序列以及l(fā)oop的大小和堿基組成，我們發(fā)現(xiàn)對于帶有3'-末端懸垂結(jié)構(gòu)的shRNA序列，其3'-臂鏈RNA干擾活性與shRNA的熱力學穩(wěn)定性質(zhì)密切相關(guān)，即與loop的大小密切相關(guān)。這些結(jié)構(gòu)因素的優(yōu)化使得我們首次得到了超高效RNA干擾效果(IC50達到8 pM)，我們也發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)優(yōu)化，可以同時降

8、低隨從鏈干擾活性，使得siRNA雙鏈各自的鏈選擇性達到1000倍，實現(xiàn)了siRNA成藥性的高活性和高靶標特異性要求。這一類shRNA的超高效活性和超高效鏈選擇性的發(fā)現(xiàn)，暗示大家已經(jīng)接受的RNA干擾機制并不是完全清楚的過程。這些結(jié)果為我們進一步深入理解RNA干擾過程提供了新的啟示。
　　本工作中所發(fā)現(xiàn)的純天然RNA修飾而建立的RNA二級結(jié)構(gòu)與RNA干擾過程的構(gòu)效關(guān)系，促使我們思考，能否通過更加利于生物制藥的化學修飾，來同時實現(xiàn)siR

9、NA成藥性的高活性和高靶標特異性（超高效鏈選擇性）。
　　二、高活性以及高穩(wěn)定性化學修飾siRNA的設(shè)計合成與性質(zhì)表征。
　　通過具有良好生物相容性的巰基-邁克爾加成反應，我們使用小分子linker將末端巰基修飾的siRNA正義鏈和反義鏈進行交聯(lián)，構(gòu)建不同類型的單端交聯(lián)發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA和雙端交聯(lián)啞鈴結(jié)構(gòu)RNA。發(fā)現(xiàn):
　　1、單端交聯(lián)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA和雙端交聯(lián)的啞鈴型結(jié)構(gòu)RNA均表現(xiàn)出了比雙鏈對照序列顯著增強的血清穩(wěn)定性

10、。雙端交聯(lián)的啞鈴型結(jié)構(gòu)RNA在50％正常人血清中的半衰期在48小時以上。這些工作表明，簡單的人工loop結(jié)構(gòu)就能夠提升RNA的血清穩(wěn)定性。
　　2、單、雙端交聯(lián)修飾的RNA序列能夠被RNA干擾途徑中的關(guān)鍵核酶Dicer選擇性識別并切割，釋放小干擾RNA，實現(xiàn)其RNA干擾效應。表明簡單的人工loop結(jié)構(gòu)并不會極大干擾RNA干擾過程。當然，如何實現(xiàn)對RNA干擾過程的精調(diào)，從而實現(xiàn)Dicer調(diào)控的RNA干擾過程的緩釋控制，仍然需要進一步

11、的優(yōu)化工作。
　　3、我們將構(gòu)成交聯(lián)修飾序列的siRNA中反義鏈定義為A鏈，其互補鏈為B鏈。LhpRNA（B鏈5'接A鏈3'-loop結(jié)構(gòu)，具有B鏈3'懸垂結(jié)構(gòu)）顯示出B鏈RNA干擾活性顯著優(yōu)于RhpRNA序列（A鏈5'接B鏈3'-loop結(jié)構(gòu)，具有A鏈3'懸垂結(jié)構(gòu)）;相反的，RhpRNA中A鏈RNA干擾活性顯著優(yōu)于LhpRNA。同時，右端交聯(lián)序列RhpRNA表現(xiàn)出了極高的反義鏈RNA干擾活性，其對于靶標mRNA沉默的IC50值6

12、 pM，為迄今所報道的最高效RNA干擾結(jié)果。
　　三、小分子依諾沙星增效RNA干擾過程的分子機制研究。
　　我們實驗室發(fā)現(xiàn)，小分子抗生素依諾沙星具有對于RNA干擾活性的增強效應?？紤]到抗生素依諾沙星通過形成與DNA雙鏈復合物從而抑制DNA解旋酶(DNA gyrase)的殺菌機理，我們提出假設(shè):依諾沙星可能是通過與RNA解旋酶相互作用從而起到RNA干擾增效作用。文獻報道RHA（RNA解旋酶A）影響RISC復合物的上載，這些工作

13、促使我們聯(lián)想依諾沙星與RHA在RNA干擾途徑中的協(xié)同作用的可能性及其相互作用模式。通過在RHA正常表達、過量表達以及沉默的HEK293細胞中，對依諾沙星與RHA對于RNA干擾的調(diào)控現(xiàn)象的觀察，我們發(fā)現(xiàn):
　　1、依諾沙星對于siRNA雙鏈的任一鏈均具有RNA干擾增強作用;
　　2、在RHA特異性沉默的HEK293細胞中，依諾沙星的增強效應降低或者消失。顯示依諾沙星對于RNA干擾活性的增強效應具有RHA蛋白表達依賴性。

14、　　四、使用新型H2S熒光探針探索細胞內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生和抑制過程。
　　內(nèi)源性H2S生物學最近開始引起研究者關(guān)注，其具體機制仍然不甚清楚。考慮到H2S的強生物還原性，我們認為它不僅可能在信號轉(zhuǎn)導過程中有重要作用，也可能在維持體內(nèi)氧化還原平衡中起到重要作用。文獻中認為內(nèi)源性H2S的手性氨基酸起源仍然需要有效的機制驗證和發(fā)現(xiàn)。我們發(fā)展了基于FRET效應的比例型H2S熒光探針SR400，該熒光探針能滿足在活細胞中高靈敏度、高特異性、原

15、位實時定量地對于H2S進行檢測。使用SR400探索HEK293細胞中內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生和抑制過程。我們發(fā)現(xiàn):
　　1、D-半胱氨酸能夠比L-半胱氨酸更加有效地誘導內(nèi)源性H2S產(chǎn)生;
　　2、D/L-PPG分子能夠同時抑制D-半胱氨酸和L-半胱氨酸對于細胞內(nèi)源性H2S的誘導產(chǎn)生過程;
　　3、手性差異性抑制劑D-PPG對于D-半胱氨酸誘導過程的抑制強于對于L-半胱氨酸的誘導過程;相反，L-PPG對于L-半胱氨酸誘導過程的

16、抑制強于對于D-半胱氨酸的誘導過程。這種手性依賴的細胞內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生和抑制過程提示我們，D-半胱氨酸和L-半胱氨酸對于細胞內(nèi)源性H2S的誘導產(chǎn)生過程可能基于兩條完全相異的途徑。
　　這些工作將有助于通過利用我們發(fā)展的超高效及選擇性siRNA，對H2S產(chǎn)生和抑制（平衡）機制，進行具體的酶促途徑的分類研究，從而理解內(nèi)源性H2S生物學奠定基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本博士論文圍繞如何提高RNA干擾效率（超高效性、選擇性），系統(tǒng)研究了

17、RNA二級結(jié)構(gòu)對RNA干擾效率的構(gòu)效關(guān)系。我們通過化學修飾siRNA，改變其拓撲結(jié)構(gòu)（loop結(jié)構(gòu)），顯著提高了雙鏈siRNA引導鏈的干擾活性及鏈間選擇性，以及RNA血清穩(wěn)定性。我們由此獲得迄今最高效的siRNA設(shè)計（IC50值＜10pM，鏈選擇性可達1000倍）。我們發(fā)現(xiàn)，依諾沙星以及RHA(RNA解旋酶A)分別對于siRNA雙鏈的任一鏈均具有RNA干擾增強作用。與此同時，依諾沙星對于RNA干擾活性的增強效應具有RHA蛋白表達依賴性。