L-酪氨酸代謝平臺構建及其在丹參素合成中的應用.pdf

1、L-酪氨酸是一種重要的芳香環(huán)平臺化合物,廣泛應用于食品、醫(yī)藥以及化工等領域。由于天然微生物合成積累L-酪氨酸的能力很低,研究從生物質碳源如葡萄糖到L-酪氨酸途徑的全局代謝優(yōu)化,構建高產L-酪氨酸代謝平臺,并應用于衍生物的合成具有重要意義。
　　本文基于模塊化代謝工程的理念,設計并合成了BldgBrick模塊組裝系統(tǒng),構建了包含L-酪氨酸代謝途徑、糖轉運系統(tǒng)、TCA循環(huán)以及抗逆性基因等12個基因在的四個模塊。通過對模塊之間適配性的篩

2、選發(fā)現(xiàn),由LacUV5啟動子控制aroGfbr-tyrAfbr-aroE組成的模塊1和由trc啟動子控制的ppsA-tktA-glk組成的模塊2組合在一起的pYBT5質粒適配性最佳。利用λRed同源重組技術,通過連續(xù)基因敲除,構建了ptsG、tyrR、pykA、pykF和pheA的5個不同缺失的BAK底盤菌株。模塊與底盤細胞的適配性表明,pYBT5與BKT5菌株為最優(yōu)L-酪氨酸工程菌株,發(fā)酵72h,L-酪氨酸產量為702mg/L,產率達

3、到理論得率19.5％。利用人工設計anti-csrAsRNA2沉默E.colicsrA基因,提高L-酪氨酸產量約1.2倍。
　　以L-酪氨酸為平臺化合物,重新設計了由4-羥基苯乙酸間位羥化酶基因(hapBC)和突變的D-乳酸脫氫酶基因(d-ldhY52A)組成的人工丹參素合成模塊,構建了丹參素工程菌株BKD5。發(fā)酵72h的丹參素產量達7.14g/L,產率為0.47mol/mol葡萄糖。
　　本文采用合成生物學,通過代謝途徑模