Ti表面固定層粘連蛋白-肝素-SDF-1α以構(gòu)建抗凝及誘導(dǎo)內(nèi)皮再生微環(huán)境的研究.pdf

1、血栓及再狹窄等術(shù)后并發(fā)癥仍然是制約心血管支架臨床應(yīng)用的主要因素。多年來，盡管研究者們對血管支架的工藝參數(shù)等進(jìn)行了大量設(shè)計(jì)和優(yōu)化，但仍難以避免并發(fā)癥的發(fā)生。血管內(nèi)皮層具有天然的抗凝血和抗內(nèi)膜過度增生的功能，因此，在心血管材料表面形成一層完整的內(nèi)皮層被廣泛認(rèn)為是解決術(shù)后并發(fā)癥的理想方法。目前，通過材料表面仿生微環(huán)境構(gòu)建加速表面內(nèi)皮化已成為研究熱點(diǎn)，但迄今為止，研究者們尚未找到一種理想的表面理化性質(zhì)和生物功能的組合，來滿足臨床上對心血管材料生

2、物相容性的要求?；谘軆?nèi)皮再生的機(jī)理，本文在Ti基材料表面分別構(gòu)建了共價(jià)型和納米顆粒裝載型兩種層粘連蛋白/肝素/SDF-1α多功能微環(huán)境，以期實(shí)現(xiàn)在抗凝和抗增生的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)并加速材料表面血管內(nèi)皮再生。論文主要內(nèi)容如下。
　　(1)共價(jià)型層粘連蛋白/肝素/SDF-1α微環(huán)境的構(gòu)建與研究。第一步，Ti經(jīng)堿熱活化處理后，通過靜電結(jié)合作用將富含氨基的多聚賴氨酸組裝于Ti表面;第二步，將一定濃度比例的層粘連蛋白/肝素共混，通過EDC偶聯(lián)

3、劑將共混共價(jià)固定于材料表面;最后，利用肝素與SDF-1α之間的特異性結(jié)合作用，進(jìn)一步將SDF-1α組裝于材料表面。在第二步中，由于層粘連蛋白和肝素之間存在相互結(jié)合的作用，因此改變層粘連蛋白的濃度比例不僅會(huì)影響材料表面蛋白質(zhì)的固定密度，也會(huì)間接影響表面肝素的固定量和活性。本研究通過詳細(xì)的理化性質(zhì)表征和生物相容性評價(jià)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)層粘連蛋白/肝素共混濃度達(dá)到0.2/5.0 mg*ml-1時(shí)，材料表面具有最優(yōu)的細(xì)胞相容性和血液相容性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)

4、一步表明，該工藝在體內(nèi)能有效促進(jìn)內(nèi)皮再生，并抑制血栓形成和內(nèi)膜增生。優(yōu)化工藝中引入SDF-1α后，發(fā)現(xiàn)并未對血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖行為產(chǎn)生明顯的效果，但能夠在一定程度上促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，并能夠顯著增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞向材料表面的歸巢。
　　(2)納米顆粒裝載型層粘連蛋白/肝素/SDF-1α微環(huán)境的構(gòu)建與研究。第一步，將一定濃度比例的層粘連蛋白/肝素復(fù)合物與多聚賴氨酸共混，利用肝素與多聚賴氨酸可通過靜電作用自發(fā)組裝形成

5、納米顆粒的特性，制備出載有層粘連蛋白的肝素/多聚賴氨酸納米顆粒;第二步，在Ti表面沉積聚多巴胺涂層，利用納米顆粒表面暴露的氨基可與多巴胺發(fā)生西弗堿反應(yīng)的特性，將納米顆粒固定于材料表面;最后，利用肝素與SDF-1α之間的特異性結(jié)合作用，將SDF-1α進(jìn)一步組裝于納米顆粒修飾的表面。在第一步納米顆粒載體的制備中，發(fā)現(xiàn)改變肝素與多聚賴氨酸的濃度比例會(huì)影響顆粒的尺寸、穩(wěn)定性以及在多巴胺表面的固定密度，通過體外生物相容性評價(jià)發(fā)現(xiàn)當(dāng)肝素與多聚賴氨酸

6、濃度比例大于（7.0/0.5 mg*ml-1）時(shí)，表面具有選擇性促進(jìn)內(nèi)皮和內(nèi)皮祖細(xì)胞生長，而抑制凝血和平滑肌過度增殖的效果。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白裝載后，顆粒在材料表面的固定密度會(huì)增加，通過進(jìn)一步的體外生物相容性評價(jià)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)肝素與多聚賴氨酸濃度比例為10.0∶0.5時(shí)，材料表面具有最優(yōu)的細(xì)胞相容性和血液相容性。該工藝中進(jìn)一步組裝SDF-1α后，發(fā)現(xiàn)對ECs的增殖行為無明顯影響，但能有效抑制凝血，同時(shí)促進(jìn)ECs的遷移，EPCs的粘附

7、和歸巢。
　　(3)兩類微環(huán)境的對比研究。為了進(jìn)一步探索表面合理的生物微環(huán)境的構(gòu)建方式，本文對兩類微環(huán)境的最優(yōu)工藝進(jìn)行了體外和體內(nèi)生物相容性對比研究。研究發(fā)現(xiàn)，共價(jià)型微環(huán)境中生物分子的穩(wěn)定性高，而納米顆粒裝載型微環(huán)境則表現(xiàn)出持續(xù)性控制生物分子釋放的能力;共價(jià)型微環(huán)境中層粘連蛋白暴露密度較高，但肝素生物活性和SDF-1α組裝量明顯低于納米顆粒組;兩類微環(huán)境促進(jìn)ECs和EPCs生長水平相當(dāng)，但納米顆粒裝載型微環(huán)境具有更加優(yōu)異的抗凝、抗

8、炎以及誘導(dǎo)EPCs動(dòng)員歸巢的能力;動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)納米顆粒裝載型微環(huán)境能更有效的抑制血管內(nèi)膜過度增生。
　　(4)構(gòu)建時(shí)序功能性表面微環(huán)境的探索性研究?；趦深愇h(huán)境的對比研究結(jié)果，以及對材料植入血管內(nèi)后引起的生物學(xué)應(yīng)答進(jìn)程的認(rèn)識(shí)，本研究進(jìn)一步提出了構(gòu)建時(shí)序功能性表面的初步構(gòu)想。即材料表面構(gòu)建的生物微環(huán)境應(yīng)當(dāng)能夠在不同的病理學(xué)階段提供相對應(yīng)的治療。本文選擇特定的納米顆粒載體（肝素與PLL濃度比例為5.0/0.5 mg*ml-1）作

9、為時(shí)序性功能研究對象，通過設(shè)立體外動(dòng)態(tài)釋放模型，以及體外和體內(nèi)的生物相容性評價(jià)，發(fā)現(xiàn)納米顆粒修飾的表面具有良好的生物分子控釋能力，能夠?qū)崿F(xiàn)1～7天內(nèi)有效抑制凝血、炎癥和平滑肌過度增殖，7～14天選擇性促進(jìn)內(nèi)皮再生，而抑制凝血和平滑肌過度增殖，以及14～28天保持良好的血液相容性和促內(nèi)皮再生的時(shí)序性要求。
　　綜上，本文選擇層粘連蛋白、肝素和SDF-1α作為功能分子，借助生物分子之間的相互作用，對構(gòu)建工藝進(jìn)行了合理優(yōu)化，并最終分別篩