培養(yǎng)條件對(duì)保加利亞乳桿菌蛋白水解體系關(guān)鍵酶基因表達(dá)影響的研究.pdf

1、乳酸菌作為發(fā)酵劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于乳制品生產(chǎn)加工過(guò)程中。由于乳酸菌自身不能直接利用外源蛋白質(zhì)，必須通過(guò)蛋白水解體系將外源蛋白水解為游離氨基酸，供菌體正常生長(zhǎng)需要。乳酸菌的蛋白水解體系包括胞外酶、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和胞內(nèi)肽酶三個(gè)部分。首先，胞外酶將外源蛋白質(zhì)水解為多肽;多肽由轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)送至胞內(nèi);再由胞內(nèi)肽酶將其水解為游離氨基酸。因此，蛋白水解體系中各種蛋白酶的活性及其基因的表達(dá)情況直接影響乳酸菌發(fā)酵劑的品質(zhì)。蛋白水解體系中各種蛋白酶基因的表達(dá)不僅在不同

2、菌株之間和不同生長(zhǎng)階段存在差異，還受到氮源的種類和含量、培養(yǎng)基初始pH和培養(yǎng)溫度的影響。
　　 本實(shí)驗(yàn)選取蛋白水解能力較高的保加利亞乳桿菌，對(duì)其蛋白水解體系中部分關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究。菌體經(jīng)活化后分別在正常液體MRS培養(yǎng)基、N缺乏MRS培養(yǎng)基和添加酪蛋白胨的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后備用，正常液體MRS培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)至5.6、5.9、6.2和6.5，培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為30℃、37℃、42℃和45℃。利用實(shí)時(shí)熒光

3、定量PCR技術(shù)測(cè)定目的基因(OppD、PrtB、PepC、PepF、PepQ、PepX、PepT)在不同菌株之間、不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同氮源、不同初始pH和不同溫度培養(yǎng)下的表達(dá)量，分析保加利亞乳桿菌蛋白水解體系中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的變化規(guī)律。
　　 試驗(yàn)結(jié)果表明，保加利亞乳桿菌蛋白水解體系中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)在不同菌株之間存在顯著差異(p＜0.05)，但是未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。
　　 隨著菌體的不斷生長(zhǎng)，關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著

4、的下調(diào)趨勢(shì)(p＜0.05)。各目的基因在對(duì)數(shù)初期(6h)的表達(dá)量是實(shí)驗(yàn)中選取四個(gè)時(shí)間點(diǎn)中的最大值;隨著菌體的不斷生長(zhǎng)，到對(duì)數(shù)中期(12h)和對(duì)數(shù)末期(18h)時(shí)，表達(dá)量與對(duì)照組(6h)相比，顯著下調(diào);在培養(yǎng)時(shí)間18h時(shí)，各目的基因的下降幅度與對(duì)照組相比均較大，平均下降了15.6倍，差異極顯著(p＜0.01)。到穩(wěn)定期(24h)時(shí)各基因的表達(dá)量降到最低，與對(duì)數(shù)初期的表達(dá)量相比平均下降了34倍，差異極顯著(p＜0.01)。
　　 在

5、N缺乏培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)12h,OppD、PrtB和PepF的表達(dá)量與正常狀態(tài)培養(yǎng)下（對(duì)照組）相比顯著上調(diào)，平均分別上調(diào)1.7倍、2.4倍和3.2倍。而其他基因的表達(dá)水平在不同菌株之間呈現(xiàn)顯著差異。在添加酪蛋白胨的培養(yǎng)條件下，各目的基因的表達(dá)水平與對(duì)照組相比均顯著下調(diào)。
　　 培養(yǎng)基的初始pH對(duì)目的基因表達(dá)也存在顯著影響。在部分菌株(08006、08007、08012、08016)中，各基因的表達(dá)水平隨著pH值的升高而升高。其中，

6、各目的基因在初始pH6.5時(shí)的表達(dá)量與對(duì)照組(pH5.6)相比上調(diào)了3.9-10.0倍。而在其他菌株(08014、08015、08017)中各目的基因的表達(dá)量與對(duì)照組(pH5.6)相比顯著下降，在pH5.9時(shí)平均下調(diào)了2.1倍:但是，在pH5.9、pH6.2和pH6.5之間的變化較平穩(wěn)。由此看來(lái)，基因的表達(dá)水平受到諸多因素的影響，并且在菌株之間存在顯著差異.
　　 培養(yǎng)溫度過(guò)高(45℃)，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)過(guò)快，較先進(jìn)入穩(wěn)定期，因此基

7、因的表達(dá)量與低溫度培養(yǎng)時(shí)顯著下調(diào)，與對(duì)照組(30℃)相比下調(diào)幅度為2.0-10.7倍，這與不同生長(zhǎng)階段基因的表達(dá)結(jié)果相符。培養(yǎng)溫度過(guò)低，對(duì)于部分菌體來(lái)說(shuō)，抑制其生長(zhǎng)，同樣導(dǎo)致基因的水平降低。
　　 綜上所述，保加利亞乳桿菌蛋白水解體系中關(guān)鍵酶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況在同一菌種不同菌株之間存在顯著差異，并且基因的表達(dá)量從菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)初期到穩(wěn)定期呈現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢(shì)。此外，菌體培養(yǎng)環(huán)境中氮源含量及種類、初始pH和培養(yǎng)溫度對(duì)基因表達(dá)