鈣依賴型蛋白酶Calpain介導(dǎo)的蛋白水解對(duì)粘附斑解體作用的研究.pdf

1、鈣依賴型蛋白酶calpain可以以多種組成粘附斑的分子元件為底物而將其裂解,使粘附斑解體,因而可能是誘導(dǎo)粘附斑解體的主要原因。分別使用上皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)或蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)激活或抑制calpain2的蛋白水解酶活性,通過免疫熒光和Western Blot等技術(shù)來研究calpain2對(duì)由paxillin和vinculin等幾種細(xì)胞骨架蛋白構(gòu)成的粘附斑的

2、裂解效果。證明calpain2水解蛋白是導(dǎo)致細(xì)胞尾部粘附斑水解的主要因?yàn)椤Ｔ谏鞢a2+濃度條件下,此步驟可受EGF和PKA調(diào)控。免疫熒光證實(shí)在EGF激活條件下,粘附斑水解的程度增強(qiáng),但在數(shù)目僅表現(xiàn)為減少,減少程度并不與誘導(dǎo)時(shí)間呈對(duì)應(yīng)關(guān)系；而粘附斑大小整體下降,且下降程度與時(shí)間呈對(duì)應(yīng)關(guān)系。在PKA抑制條件下,抑制程度隨PKA濃度增加增強(qiáng),其中5μg/ml及以上濃度抑制作用明顯。Western Blot結(jié)果顯示在EGF或PKA激活或抑制條

3、件下paxillin和vinculin在細(xì)胞內(nèi)的含量均無明顯變化,表明Calpain依賴于通過調(diào)節(jié)talin蛋白的水解來調(diào)節(jié)paxillin、vinculin等其它組成粘附斑的細(xì)胞骨架蛋白水解。因此Calpain對(duì)talin蛋白水解的調(diào)節(jié),對(duì)粘附斑解體至關(guān)重要。已確定talin的calpain酶切位點(diǎn)為其第432位的亮氨酸(Leu432),其第144位蘇氨酸、第150位蘇氨酸和第446位色氨酸(Thr144、Thr150、Ser446)