堆型艾美耳球蟲ADF基因和3-1E基因融合表達(dá)及其免疫保護(hù)性試驗(yàn).pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是由艾美耳屬(Eimeria)的多種球蟲寄生于雞消化道引起感染的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的原蟲病,目前該病的防治主要依靠化學(xué)藥物,長(zhǎng)期應(yīng)用藥物易使球蟲產(chǎn)生耐藥性,以及在肉蛋中藥物殘留危害人體健康,因此研究人員期望用更好的手段來(lái)控制雞球蟲病。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)和基因工程學(xué)的發(fā)展,亞單位疫苗作為一種安全、穩(wěn)定、高效和易于制備的疫苗而得到廣泛研究。本試驗(yàn)對(duì)雞堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina)

2、相關(guān)抗原基因ADF和3-1E進(jìn)行了重組克隆共表達(dá),并用重組蛋白進(jìn)行了免疫保護(hù)試驗(yàn),為研制高效、安全的抗球蟲多價(jià)疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 參考GenBank中收錄的Eacervulina肌動(dòng)蛋白解聚因子(actin-depolymerizingfactor,ADF)基因序列,設(shè)計(jì)特異性引物,以保定株堆型艾美耳球蟲卵囊子孢子DNA為模板,用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法擴(kuò)增ADF基因,經(jīng)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物為729bp。將擴(kuò)增的ADF基因克隆至pM

3、D-18T載體,轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞DH5a,藍(lán)白斑法篩選出陽(yáng)性重組子,提取陽(yáng)性質(zhì)粒DNA并測(cè)序。序列分析結(jié)果表明,該株的ADF基因序列與參考序列同源性達(dá)99.6％。將擴(kuò)增產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET32a(+)連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-ADF,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定。結(jié)果表明表達(dá)出的ADF基因重組蛋白分子量大小約為46kDa。
　　 應(yīng)用重疊PCR技術(shù)(SOE-PCR)將ADF

4、基因和3-1E基因融合得到ADF-3-1E重組基因,并將融合基因插入到pET-32a(+)載體中,構(gòu)建成了pET-32a-ADF-3-1E共表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化BL21宿主菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明,表達(dá)的融合蛋白分子量約為68kDa,與預(yù)測(cè)的蛋白大小相符。經(jīng)Westernblot鑒定表明,表達(dá)的融合蛋白具有很好的反應(yīng)原性。
　　 將100只雛雞隨機(jī)分為5組,分別設(shè)ADF重組蛋白免疫組、3-1E重組