巨型艾美球蟲配子體gam56基因的克隆與表達(dá)及其免疫保護(hù)性試驗(yàn).pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是由艾美屬(Eimeria)的多種球蟲寄生于雞消化道引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的原蟲病，全世界每年因雞球蟲病而造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20億美元以上。我國是養(yǎng)雞大國，占世界總養(yǎng)雞量的10％，每年由雞球蟲病造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失難以估計(jì)。目前球蟲病主要依靠藥物防治，但由于球蟲耐藥性的不斷增強(qiáng)以及藥物殘留肉蛋危害人體健康，使得藥物防治雞球蟲病舉步維艱，也迫使人們將目光轉(zhuǎn)向免疫預(yù)防等替代控制方法。本研究對(duì)巨型艾

2、美球蟲南通株(E.maxima，NT株)配子體抗原gam56基因進(jìn)行了克隆、序列分析和原核表達(dá)，以及gam56抗原對(duì)E.maxima的免疫保護(hù)作用，為在臨床上利用亞單位疫苗控制雞球蟲病奠定基礎(chǔ)。 一、巨型艾美球蟲配子體gain 56基因的克隆和序列分析以Emaxima NT株純化的配子體提取的總RNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用兩步法RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出gam56基因的特異性片段。將擴(kuò)增片段插入pGEM-T載體，隨機(jī)選擇經(jīng)藍(lán)白

3、斑篩選、PCR及酶切鑒定為陽性的2個(gè)克隆分別進(jìn)行測(cè)序分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，2個(gè)陽性克隆所含插入片段的DNA序列完全一致，含一全長1431個(gè)核苷酸的開放閱讀框。其序列與EmaximaHoughton株的開放閱讀框一致。 二、巨型艾美球蟲配子體gam 56基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)根據(jù)Emaxima NT株gam56抗原基因的cDNA序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，經(jīng)PCR從陽性質(zhì)粒模板中擴(kuò)增出gam56基因不含信號(hào)肽的編碼區(qū)片段。將

4、該基因片段酶切回收后按正確的閱讀框架克隆入大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-6P-1谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的下游，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-gam56-1和pGEX-6P-1-gam56-2，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。重組菌經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，通過SDS-PAGE電泳，gam56基因的2個(gè)片段在大腸桿菌中得到了融合表達(dá)，融合蛋白分子量分別約為44 Ku和38 Ku?？扇苄苑治霰砻?，pGEX-6P-1-gam56-1融合蛋白主要以包涵體形式存在，

5、而pGEX-6P-1-gain56-2融合蛋白則主要以可溶性形式存在。三、巨型艾美球蟲重組抗原gam56-2的免疫保護(hù)效果試驗(yàn)以Eaxima配子體抗原的基因工程重組菌pGEX-6p-1.gam56-2/BL21誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物-重組gam56-2蛋白為抗原，加或不加弗氏完全佐劑，制備免疫原。分別設(shè)3個(gè)劑量組，經(jīng)皮下注射，于5日齡、12日齡和19日齡對(duì)雛雞進(jìn)行3次免疫，同時(shí)設(shè)立未免疫未攻毒組和未免疫攻毒組作對(duì)照。在26日齡時(shí)用5×104個(gè)Em

6、axima南通株孢子化卵囊進(jìn)行攻毒，8 d后撲殺，對(duì)各組的存活率、相對(duì)增重率、病變記分減少率、卵囊減少率和抗球蟲指數(shù)(ACI)等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，就相對(duì)增重率而言各免疫組較未免疫攻毒組的要高27個(gè)百分點(diǎn)以上，均有一定的保護(hù)作用；但就病變記分減少率與卵囊減少率指標(biāo)而言，各免疫組均小于70％與75％，判為無保護(hù)力；而從抗球蟲指數(shù)水平來看，重組蛋白中劑量佐劑組、重組蛋白低劑量佐劑組與重組蛋白中劑量組的抗球蟲指數(shù)均在