毒害艾美爾球蟲第二代裂殖子cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與篩選及3-1E基因的克隆表達(dá).pdf

1、雞球蟲病是由一種或數(shù)種艾美耳球蟲寄生于雞消化道上皮細(xì)胞內(nèi)而引起的一種原蟲寄生蟲病，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)。目前，球蟲病的防治主要依賴化學(xué)藥物或雞球蟲病活疫苗，雖然人們采取了穿梭用藥、輪換用藥、聯(lián)合用藥等各種措施，但球蟲幾乎對(duì)所有使用過(guò)的抗球蟲藥物均出現(xiàn)了耐藥性。雞球蟲病活疫苗有著較強(qiáng)的免疫效果，但存在一些突出的問(wèn)題，如有擴(kuò)散病原的風(fēng)險(xiǎn)、疫苗接種劑量難以控制、影響飼料報(bào)酬等。因此，雞球蟲保護(hù)性抗原基因的篩選與克隆表達(dá)及其免疫保護(hù)力的研究一直是雞球

2、蟲病研究的熱點(diǎn)。毒害艾美耳球蟲（Eimeria necatrix）是雞球蟲病的重要病原，在臨床上常危害8～18周齡的雞，引起雞的急性小腸球蟲病。迄今，從毒害艾美耳球蟲克隆的抗原基因甚少。為此，本研究應(yīng)用SMART技術(shù)構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲（E.necatrix）第二代裂殖子cDNA文庫(kù)，并用免疫學(xué)方法從文庫(kù)中篩選抗原基因，并對(duì)3-1E基因進(jìn)行了克隆表達(dá)和免疫原性分析，為研究毒害艾美耳球蟲亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　1、毒害艾美耳球蟲第

3、二代裂殖子的分離純化
　　28日齡無(wú)球蟲雛雞，每雞經(jīng)嗉囊感染20000個(gè)毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊。感染150h后撲殺、剖檢雞，刮取小腸中段腸黏膜組織，研磨后用1 mmol/L透明質(zhì)酸酶消化，釋放裂殖子;隨后經(jīng)4層棉紗布、260目錦綸篩兜和17μm PET膜過(guò)濾，濾液經(jīng)離心洗滌后用裂解液裂解紅細(xì)胞;最后用30％和50％的Percoll，5200 rpm離心15 min，分離純化裂殖子。結(jié)果表明，該方法操作程序簡(jiǎn)單，分離效果好，獲得的

4、裂殖子無(wú)雜質(zhì)，其純度適用于分子生物學(xué)方面的研究。
　　2、毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
　　用Trizol試劑提取毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA，用oliogo(dT)磁珠法純化mRNA，隨后采用SMART技術(shù)構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA噬菌體表達(dá)文庫(kù)。經(jīng)鑒定，原始文庫(kù)庫(kù)容量2.14×106 pfu/mL，擴(kuò)增后的庫(kù)容量約為4.47×1010pfu/mL，擴(kuò)增后的文庫(kù)重組率為90％;隨機(jī)挑取1

5、00個(gè)單克隆，通過(guò)菌液PCR檢測(cè)得知文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度以400 bp～1000 bp為主。結(jié)果顯示，構(gòu)建的cDNA噬菌體表達(dá)文庫(kù)達(dá)到SMART高質(zhì)量文庫(kù)指標(biāo)。
　　3、毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫(kù)的篩選
　　首先，用毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊經(jīng)嗉囊感染雛雞，制備抗毒害艾美耳球蟲的雞康復(fù)血清;用純化的毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子可溶性蛋白為抗原免疫小鼠，制備鼠抗毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子多抗血清;兩種血清經(jīng)ELISA檢測(cè)，

6、顯示兩種多抗均有很高的效價(jià);隨后，按試劑盒規(guī)定方法，用雞康復(fù)血清和鼠抗代裂殖子血清對(duì)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選，經(jīng)初篩分別獲得出11個(gè)和7個(gè)陽(yáng)性克隆，其中有5個(gè)克隆為雙陽(yáng)性;接著，對(duì)5個(gè)雙陽(yáng)性克隆進(jìn)行復(fù)篩直至整個(gè)膜上均為陽(yáng)性克隆為止;最后，對(duì)復(fù)篩后獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定，其PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序，對(duì)獲得的EST序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，5個(gè)EST序列的長(zhǎng)度分別為599、723、516、939和899bp，編碼的蛋白分別

7、與毒害艾美耳球蟲假定蛋白，日本血吸蟲SJCHGC02770蛋白、SJCHGC00839蛋白和SJCHGC09095蛋白，柔嫩艾美耳球蟲核糖體蛋白P2，毒害艾美耳球蟲60S核糖體蛋白L8和柔嫩艾美耳球蟲50S核糖體蛋白L2，以及巨型艾美耳球蟲Ⅰ型細(xì)胞色素氧化酶有很高的同源性。
　　4、毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子3-1E基因的克隆表達(dá)
　　首先，根據(jù)堆型艾美耳球蟲子孢子3-1E基因序列設(shè)計(jì)引物，以毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子總RN

8、A為模板，用RT-PCR方法擴(kuò)增基因片段;將目的片段插入到pGEM-T-Easy載體，常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，藍(lán)白斑篩選后對(duì)經(jīng)酶切和PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。隨后，根據(jù)3-1E基因的ORF序列和質(zhì)粒pET-28a(+)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以重組質(zhì)粒pGEM-T-Easy-3-1E為模板擴(kuò)增出表達(dá)片段，將該片段與載體pET-28a(+)連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-3-1E，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)