豹蛙抗瘤酶及其融合蛋白的畢赤酵母表達(dá)、中試、分離純化與結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)性研究.pdf

1、豹蛙抗瘤酶(onconase，ONC)是一種新型抗癌藥物，對(duì)多種實(shí)體瘤有很強(qiáng)的殺傷作用，是首個(gè)進(jìn)入抗腫瘤臨床試驗(yàn)的核糖核酸酶，也是當(dāng)前全球重點(diǎn)研究的100種新藥之一。目前臨床使用的ONC均為天然ONC，提取過(guò)程繁瑣，來(lái)源受限，無(wú)法大規(guī)模應(yīng)用，利用生物工程技術(shù)制備重組ONC(recombinant ONC，rONC)已經(jīng)取得一些進(jìn)展，但獲得的rONC仍存在表達(dá)量低和活性不高等問(wèn)題。
　　本論文首次將 HSA與 ONC進(jìn)行融合表達(dá)，利

2、用重組人血清白蛋白(recombinant human serum albumin，rHSA)的高表達(dá)特性及酵母的密碼子偏好性，同時(shí)考慮到連接肽是否插入以及連接肽的不同長(zhǎng)度可能影響融合蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其功能，設(shè)計(jì)4種長(zhǎng)度的連接肽，連接肽以Gly4Ser1為模體進(jìn)行重復(fù)，重復(fù)數(shù)量分別為0、1、2和3，構(gòu)建融合蛋白基因序列，簡(jiǎn)稱HSA-M(0,1,2,3)-ONC。對(duì)ONC及HSA-M(0,1,2,3)-ONC基因序列進(jìn)行優(yōu)化（糖基化位點(diǎn)

3、突變、GC含量提高、偏好密碼子、信號(hào)肽等），構(gòu)建5種基因的7種載體-宿主菌組合并進(jìn)行了篩選，并對(duì)rONC及其融合蛋白的發(fā)酵、中試放大以及純化過(guò)程中亟需解決的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了研究，獲得了高純度和高活性的rONC及其融合蛋白。主要內(nèi)容包括：
　　(1) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的高效表達(dá)畢赤酵母工程菌的構(gòu)建及篩選：優(yōu)化ONC及HSA-M(0,1,2,3)-ONC基因序列，構(gòu)建ONC及HSA-M(0,1,2,3)-

4、ONC畢赤酵母表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)入3種宿主菌（X-33、GS115和SMD1168），對(duì)得到的7種載體-宿主組合進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，篩選得到rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC高表達(dá)菌株。結(jié)果表明，5種外源蛋白在pPICZα-A/X-33組合表達(dá)水平均高于pPIC9/GS115、pPIC9K/GS115、pPICZα-A/GS115，均顯著高于pPIC9/SMD1168、pPIC9K/SMD1168、pPICZα-A/SMD1168

5、組合。
　　(2) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的表達(dá)條件優(yōu)化：本研究對(duì)pH、誘導(dǎo)溫度、培養(yǎng)基以及甲醇濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明rONC在1 L搖瓶規(guī)模的最佳表達(dá)pH為5.5，最佳誘導(dǎo)溫度為23℃；在3 L規(guī)模條件下，最佳培養(yǎng)基為低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基（lower basic salt medium，LBSM），最佳誘導(dǎo)甲醇濃度為0.25％，rONC誘導(dǎo)7 d時(shí)表達(dá)量最高（155.0mg/L）；在1 L搖瓶規(guī)模下，

6、rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的最佳pH依次為6.5、7.0、7.0和7.0，最佳誘導(dǎo)溫度均為23℃；在3 L發(fā)酵規(guī)模條件下，最佳培養(yǎng)基為L(zhǎng)BSM，最佳誘導(dǎo)甲醇濃度為0.25%，誘導(dǎo)10 d時(shí)rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的表達(dá)量最高，分別為1.65、1.53、1.37和1.52 g/L。
　　(3) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的中試放大：在3L規(guī)?；A(chǔ)上，對(duì)rONC及rHSA-M(0,1,2

7、,3)-ONC進(jìn)行中試放大（10 L和50 L）。結(jié)果表明，rONC在10 L和50 L最佳表達(dá)條件下的表達(dá)量分別為180.0 mg/L和195.0 mg/L；rHSA-M(0,1,2,3)-ONC在10 L最佳表達(dá)條件下的表達(dá)量分別為2.15、1.93、1.87、2.02 g/L，在50 L最佳表達(dá)條件下的表達(dá)量分別為2.26、2.13、1.94、2.12 g/L。
　　(4) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的

8、分離純化條件摸索及純化體系放大：以rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC50L規(guī)模的發(fā)酵液為研究對(duì)象，進(jìn)行分離純化條件摸索。結(jié)果表明，經(jīng)雙水相偶聯(lián)分子排阻層析，獲得了純度高于95%，收率高于90%的rONC；經(jīng)雙水相偶聯(lián) DEAE離子交換層析，獲得了純度均高于95%，收率均高于70%的rHSA-M(0,1,2,3)-ONC。
　　(5) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的活性測(cè)定：主要對(duì)rONC及rHSA

9、-M(0,1,2,3)-ONC的體外生物學(xué)活性(酶學(xué)活性、細(xì)胞毒性、穩(wěn)定性)進(jìn)行測(cè)定。首先利用酵母tRNA為反應(yīng)底物和酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法，測(cè)定了rONC和rHSA-M(1,2,3)-ONC的酶學(xué)活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rONC和rHSA-M(1,2,3)-ONC對(duì)tRNA降解活性從高到低依次為rONC、rHSA-M3-ONC、rHSA-M2-ONC、rHSA-M1-ONC，而rHSA-M0-ONC在相同條件下未測(cè)得tRNA降解酶學(xué)活性；其次，利用

10、SRB法測(cè)定rONC及rHSA-M(1,2,3)-ONC對(duì)18種細(xì)胞系（人實(shí)體瘤細(xì)胞、鼠實(shí)體瘤細(xì)胞、非實(shí)體瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞）活性的影響，結(jié)果表明，rONC和rHSA-M(1,2,3)-ONC抑制腫瘤細(xì)胞系的增殖，且對(duì)不同細(xì)胞系增殖的抑制作用有差異。其中，rONC對(duì)18種細(xì)胞系均有明顯的抑制增殖作用，rHSA-M0-ONC對(duì)18種細(xì)胞系均無(wú)作用，rHSA-M(1,2)-ONC對(duì)18種細(xì)胞系中的部分細(xì)胞系（Hela、RH-35、B16、2

11、93T、WISH和NIH-3T3）具有抑制增殖作用，rHSA-M3-ONC能夠?qū)?8種細(xì)胞中絕大多數(shù)(除DU145、HT-29、K562、HL-60、MEL和CHO外的12種)細(xì)胞株產(chǎn)生抑制增殖(等摩爾量條件下IC50約為rONC的3倍)，同時(shí)rONC及rHSA-M(1,2,3)-ONC對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞株的作用也要高于非實(shí)體瘤細(xì)胞株。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明：相同條件下(pH、溫度和時(shí)間)，rONC及其融合蛋白的穩(wěn)定性強(qiáng)弱依次為：rONC>rHSA-

12、M(1,2)-ONC>rHSA-M3-ONC>rHSA-M0-ONC。
　　(6) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定：利用雙抗夾心法測(cè)定rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，結(jié)果表明rONC的半衰期約為0.88±0.07 h，rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的半衰期依次為：13.16±0.31 h、14.24±0.24 h、14.86±0.12 h和1

13、4.58±0.35 h。
　　(7)結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)性分析：分析rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的一、二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)合rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的酶學(xué)活性、細(xì)胞毒性、穩(wěn)定性與半衰期，分析其結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)性，結(jié)果表明rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的酶活性和細(xì)胞毒性與連接肽長(zhǎng)度相關(guān)，其中，rONC的酶活性和細(xì)胞毒性最強(qiáng)，rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的酶活性和細(xì)胞毒性與連接肽

14、長(zhǎng)度呈正相關(guān)；而穩(wěn)定性和半衰期與連接肽長(zhǎng)度無(wú)明確相關(guān)性。進(jìn)一步分析rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，隨著rHSA-M(0,1,2,3)-ONC中連接肽長(zhǎng)度的增加，其ONC部分的二級(jí)結(jié)構(gòu)越近似rONC的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但rHSA-M(0,1,2,3)-ONC中 ONC部分有6個(gè)區(qū)域(3-10、19-23、35-45、57-69、85-89和96-102位氨基酸)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，推測(cè)此變化可能與rHSA-M(0,1,2,

15、3)-ONC活性降低有關(guān)。
　　結(jié)論：本文建立了rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的中試規(guī)模畢赤酵母高效表達(dá)及純化生產(chǎn)工藝。其中，rONC在50 L規(guī)模下表達(dá)量達(dá)到195.0mg/L，較現(xiàn)有文獻(xiàn)(150.0mg/L)提高了30%，建立了相應(yīng)規(guī)模的純化工藝，獲得了純度大于95%，收率高于90%且具有良好的生物學(xué)活性的rONC；rHSA-M(0,1,2,3)-ONC在50 L規(guī)模的表達(dá)量均達(dá)到2 g/L(等摩爾條件下rO