力學(xué)載荷與CKIP-1基因缺失對(duì)抗微重力下骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：骨質(zhì)疏松癥（OP，osteoporosis）主要是因?yàn)楣侵厮苓^程平衡被打破，骨形成與骨吸收過程中后者占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨折概率增大的一種嚴(yán)重危害患者生命健康的骨代謝疾病。大量研究表明，酪蛋白激酶2相互作用蛋白1（casein kinase2-interacting protein-1，CKIP-1）在骨組織增殖、分化過程中起重要作用，其主要與泛素連接酶Smurf1相互作用進(jìn)而影響骨生長(zhǎng)的過程；近年來，大量研究

2、證明力學(xué)環(huán)境與骨組織生長(zhǎng)狀況關(guān)系十分密切，力學(xué)載荷越來越受到大家的關(guān)注，尤其是在成骨效應(yīng)方面。
　　目的：通過尾吊飼養(yǎng)方法模擬失重環(huán)境，進(jìn)而建立失重性骨質(zhì)疏松的小鼠模型，研究小鼠脛骨軸向生理性載荷（2500με）與過載（5000με）以及CKIP-1基因敲除對(duì)骨質(zhì)疏松的對(duì)抗與治療作用；希望為臨床治療骨科相關(guān)疾病，尤其是太空環(huán)境下微重力導(dǎo)致的失重性骨疏松提供一種新的預(yù)防或治療方法，為長(zhǎng)期在太空飛行的航天員預(yù)防保健提供專業(yè)的參考意見和

3、理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.骨質(zhì)疏松模型的建立：將2-3月齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為2組，對(duì)照組（Normal）、尾吊組（TS），適應(yīng)性飼養(yǎng)1W后，對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，尾吊組進(jìn)行鼠尾懸吊飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)周期為4W，試驗(yàn)結(jié)束后分別檢測(cè)兩組小鼠脛骨微觀參數(shù)、力學(xué)性能、血生化指標(biāo)等，觀察建模結(jié)果。
　　2.不同強(qiáng)度周期性動(dòng)態(tài)力學(xué)載荷對(duì)微重力下骨質(zhì)疏松的作用：將2-3月齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組（Normal）、

4、尾吊組（TS）、尾吊+生理性載荷組（Loading）、尾吊+過載組（Overloading），適應(yīng)性飼養(yǎng)1W后，對(duì)照組正常飼養(yǎng)，其他各組尾吊飼養(yǎng)4周。尾吊期間，尾掉組小鼠不作其他處理，生理性載荷組小鼠后肢左側(cè)脛骨施加周期性動(dòng)態(tài)力學(xué)載荷（使其脛骨中段受到的峰值應(yīng)變約為2500με），過載組小鼠后肢左側(cè)脛骨施加力學(xué)載荷產(chǎn)生的微應(yīng)變約為5000με。加載時(shí)間為20min，加載頻率為15Hz，1次/3d。試驗(yàn)周期結(jié)束后，處死小鼠，斷頭取血，靜止

5、10min后，3000r/min離心30min，取上層血清﹣80℃保存，以備后用。同時(shí)，剝離出小鼠后肢離體脛骨，液氮中保存。
　　采用小動(dòng)物活體計(jì)算機(jī)斷層掃描系統(tǒng)SkyScan1076進(jìn)行Micro CT掃描實(shí)驗(yàn)進(jìn)行骨小梁微觀結(jié)構(gòu)檢測(cè)；干骺端三點(diǎn)彎曲力學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠脛骨骨組織宏觀力學(xué)性能；血清AKP與BGP含量檢測(cè)成骨活性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)成骨基因表達(dá)情況。
　　3.生理性載荷與CKIP-1基因敲除對(duì)抗微重力下

6、骨質(zhì)疏松的作用：將2-3月齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為2組，尾吊組（TS）、尾吊+生理性載荷組（Loading）；同時(shí)將CKIP-1基因敲除小鼠隨機(jī)分為2組，尾吊組（記為KO）、尾吊+生理性載荷組（記為KO+Loading），這樣得到共4組小鼠。適應(yīng)性飼養(yǎng)1W后，對(duì)照組正常飼養(yǎng)，其他各組尾吊飼養(yǎng)4周。尾吊期間，尾掉組小鼠不作其他處理，生理性載荷組小鼠后肢左側(cè)脛骨施加周期性動(dòng)態(tài)力學(xué)載荷（使其脛骨中段受到的峰值應(yīng)變約為2500με）。加載

7、時(shí)間為20min，加載頻率為15Hz，1次/3d。試驗(yàn)周期結(jié)束后，處死小鼠，斷頭取血，靜止10min后，3000r/min離心30min，取上層血清﹣80℃保存，以備后用。同時(shí)，剝離出小鼠后肢離體脛骨，液氮中保存。
　　采用小動(dòng)物活體計(jì)算機(jī)斷層掃描系統(tǒng)SkyScan1076進(jìn)行Micro CT掃描實(shí)驗(yàn)進(jìn)行骨小梁微觀結(jié)構(gòu)檢測(cè)；干骺端三點(diǎn)彎曲力學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠脛骨骨組織宏觀力學(xué)性能；血清AKP與BGP含量檢測(cè)成骨活性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

8、技術(shù)檢測(cè)相關(guān)成骨基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.骨質(zhì)疏松模型評(píng)價(jià)：小鼠尾吊4周后，與正常飼養(yǎng)小鼠相比，尾吊組小鼠骨組織大量流失，骨生物力學(xué)性能明顯降低，骨微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞、成骨活性顯著減弱，說明成功復(fù)制了骨質(zhì)疏松模型。
　　2.不同強(qiáng)度周期性力學(xué)載荷對(duì)微重力下骨質(zhì)疏松的影響：相比尾吊組，生理性載荷組改善了小鼠脛骨的宏觀力學(xué)性能（P＜0.05）；過載組也可稍改善尾吊導(dǎo)致的力學(xué)性能下降，但作用不明顯（P＞0.05）。對(duì)

9、小鼠后肢脛骨施加2500微應(yīng)變后，與尾吊組相比，生理性載荷組小鼠脛骨微觀結(jié)構(gòu)得到了顯著改善（P＜0.05），但與對(duì)照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性差異（P＜0.05）；當(dāng)脛骨承受5000微應(yīng)變時(shí)，該組骨小梁微觀結(jié)構(gòu)與尾掉組相比有改善的趨勢(shì)，但改變程度沒有顯著性差異（P＞0.05）。施加周期性動(dòng)態(tài)力學(xué)載荷可增強(qiáng)成骨活性，并抑制微重力致骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展。其中，生理性載荷作用顯著（P＜0.05），過載則作用不明顯（P＞0.05）。生理性載荷可以

10、有效上調(diào)BMP-1、Col-I、AKP的表達(dá)，增強(qiáng)成骨作用（P＜0.05）；過載亦有上述作用，但結(jié)果沒有顯著性差異（P＞0.05）。
　　3.生理性載荷與CKIP-1基因?qū)ξ⒅亓ο鹿琴|(zhì)疏松的對(duì)抗與治療作用：干骺端三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)顯示，與尾吊組相比，生理性載荷和CKIP-1基因的缺失均能顯著改善由尾吊所致小鼠脛骨組織的力學(xué)性能降低的情況，主要表現(xiàn)在其斷裂應(yīng)變、斷裂能量的提高（P＜0.05），且二者聯(lián)合作用，改善效應(yīng)增強(qiáng)。小鼠脛骨微觀參數(shù)

11、分析發(fā)現(xiàn)生理性載荷與CKIP-1基因敲除可以有效抑制尾吊所致骨密度降低、骨組織大量流失等情況（P＜0.05）。血清AKP與BGP含量測(cè)定結(jié)果顯示，生理性載荷與CKIP-1基因敲除可以提高與成骨活性相關(guān)的AKP與BGP含量，證明上述因素可以提高成骨活性（P＜0.05），促進(jìn)成骨。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，生理性載荷與CKIP-1基因敲除可以上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)（P＜0.05），抑制骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展。
　　結(jié)論：研究通過尾吊飼

12、養(yǎng)小鼠模擬微重力環(huán)境導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，盡管與真正意義上的太空微重力環(huán)境有一定的差距，并不能完全展示出微重力環(huán)境下骨質(zhì)疏松發(fā)生的過程，但是該模型作為一種較為成熟的模擬太空微重力環(huán)境的方法，其結(jié)果可以為太空長(zhǎng)期作業(yè)人員提供一種可能的預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松的方法。
　　主要結(jié)論如下：
　　1.小鼠尾吊4周后，可成功復(fù)制失重性骨質(zhì)疏松模型；
　　2.生理性載荷與CKIP-1基因敲除均可有效抑制骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展，基因的調(diào)控效應(yīng)大于力