大規(guī)模微重力擴(kuò)增肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 微重力培養(yǎng)肝細(xì)胞的微載體篩選
　　 研究背景:
　　 肝細(xì)胞是生物人工肝的主要生物成分,在其中起核心作用:生物人工肝的支持作用主要來源于肝細(xì)胞的生物代謝功能。制備一個(gè)具有較佳功能的生物人工肝,細(xì)胞數(shù)量應(yīng)達(dá)到1010數(shù)量級(jí),理想的細(xì)胞密度應(yīng)該達(dá)到107/ml,并保持功能良好。但由于人原代肝細(xì)胞來源困難,而豬肝細(xì)胞又受到潛在逆轉(zhuǎn)錄病毒的限制,因此大規(guī)模高密度培養(yǎng)和擴(kuò)增肝細(xì)胞系(甚至肝腫瘤細(xì)胞系),以接近或達(dá)到生物人

2、工肝的要求,成為生物人工肝領(lǐng)域的一個(gè)重要探索方向。
　　 目前人工肝反應(yīng)器有四種模式:中空纖維型,單層平板培養(yǎng)型,灌流平板/支架型,包裹式微球/懸液或柱狀反應(yīng)器。應(yīng)用于采集的肝細(xì)胞尚可,但如果應(yīng)用于擴(kuò)增肝細(xì)胞,則很難完全滿足人工肝高密度、高功能、長時(shí)間的培養(yǎng)要求。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)(rotational cell culture system,RCCS)模擬微重力培養(yǎng)是組織工程領(lǐng)域近年來發(fā)展出來的新方法。相對于傳統(tǒng)的方法,模擬微重力培

3、養(yǎng)具有剪切力小、空間利用度高、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化等特點(diǎn),適合進(jìn)行高密度細(xì)胞培養(yǎng)。將模擬微重力培養(yǎng)引入生物人工肝反應(yīng)器,用以高密度、大規(guī)模培養(yǎng)肝細(xì)胞,是很有希望的研究方向。課題組的前期研究也表明,RCCS培養(yǎng)的肝細(xì)胞,其功能表現(xiàn)明顯好于方瓶培養(yǎng)。
　　 RCCS培養(yǎng)肝細(xì)胞需要使用微載體,以供肝細(xì)胞在其上粘附生長。目前,各種常用商品微載體品種較多,材料也從明膠、纖維素、葡聚糖等各不相同；本課題組前期研究也制作了一種微載體,生物相容性實(shí)

4、驗(yàn)證明人肝細(xì)胞CL-1可以在其上生長。何種微載體更適合于模擬微重力條件下的肝細(xì)胞,更適合其大規(guī)模增殖,是擺在實(shí)驗(yàn)面前的實(shí)際問題。
　　 研究目的:
　　 篩選一種或幾種最適宜于RCCS條件下培養(yǎng)肝細(xì)胞的微載體。
　　 研究方法:
　　 在RCCS 50ml水平培養(yǎng)。在同一條件下將同一濃度CL-1細(xì)胞接種至4種不同微載體(葡聚糖實(shí)體微載體Cytodex3、纖維素多孔微載體Cytopore 2、明膠多孔微載體

5、Cultispher S、絲素-半乳糖基化殼聚糖微載體SF/GC)進(jìn)行微重力培養(yǎng)12天,持續(xù)對比觀察細(xì)胞生長的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞活力等情況,并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、上清中的ALT、AST、白蛋白、尿素等指標(biāo)測定,反映細(xì)胞數(shù)量和功能的情況。
　　 研究結(jié)果:
　　 CL-1細(xì)胞在微重力條件下在四種微載體上均可附著生長。掃描電鏡提示課題組自制的SF/GC微載體上細(xì)胞生長最為密實(shí),而Cultispher S上呈現(xiàn)單層成長。細(xì)胞計(jì)數(shù)以SF/G

6、C微載體最高,達(dá)到5.71±0.49*106個(gè)/ml,Cytopore 2最低,為2.96±0.35*106個(gè)/ml；AST隨培養(yǎng)時(shí)間增加而逐漸升高,最高值達(dá)到136.81±10.97IU/L；白蛋白分泌和尿素合成均為SF/GC組最高,分別為455.28±37.33ng/mL和3.60±0.26mmol/L,Cultispher S組最低,分別為212.17±22.14 ng/mL和2.52±O.12 mmol/L。
　　 研究

7、結(jié)論:
　　 SF/GC微載體是在RCCS 50ml水平最適合培養(yǎng)CL-1細(xì)胞的微載體。而Cultispher S相對不適用于培養(yǎng)CL-1細(xì)胞。
　　 第二部分RCMw微重力循環(huán)大規(guī)模培養(yǎng)肝細(xì)胞的研究
　　 研究背景:
　　 理想的生物人工肝反應(yīng)器,體積應(yīng)為1000ml左右,細(xì)胞密度在107/ml左右,同時(shí)細(xì)胞具備良好的功能,能夠維持24小時(shí)以上；在第一部分研究中,RCCS50ml水平,實(shí)驗(yàn)取得了較為滿意

8、的結(jié)果,細(xì)胞數(shù)量峰值平均達(dá)到了3.5*106個(gè)/ml,最高值達(dá)到了6*105個(gè)/ml。初步證明:以微重力培養(yǎng)的方法擴(kuò)增肝細(xì)胞有潛在的可行性。鑒于RCCS50ml采用的仍然是換液模式,這種模式對細(xì)胞培養(yǎng)的密度和功能,尤其是體積上仍有較大的限制；課題組在獲得50ml的研究結(jié)果后,即從NASA中心引進(jìn)了RCCS最新的灌注培養(yǎng)系統(tǒng)RCMw 500ml,以期灌注培養(yǎng)能夠進(jìn)一步提高細(xì)胞密度,并放大培養(yǎng)體積,接近大規(guī)模高濃度培養(yǎng)1010個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)目

9、的。
　　 研究目的:
　　 探索以RCMW500ml進(jìn)行CL-1細(xì)胞高密度培養(yǎng)的條件。
　　 研究方法:
　　 在RCMW 500ml水平培養(yǎng)。按照RCMW操作說明進(jìn)行,培養(yǎng)液、pH調(diào)節(jié)、載體處理和濃度、接種方式、取樣測定等,均與RCCS 50ml相同。培養(yǎng)12d,連續(xù)取樣,對比觀察CL-1細(xì)胞在Cytodex3和Cytopore 2上的生長情況和功能情況,并設(shè)立空白對照組。觀察指標(biāo)包括:細(xì)胞計(jì)數(shù)、活力

10、染色、ALT、AST、白蛋白、尿素。
　　 研究結(jié)果:
　　 肝細(xì)胞在RCMW上生長極為緩慢。形態(tài)學(xué)觀察提示大量游離細(xì)胞,細(xì)胞活力差。在兩種微載體上的細(xì)胞計(jì)數(shù)峰值最高為1.01±0.12*106個(gè)/ml,Cytodex 3略高于Cytopore 2；而上清中白蛋白濃度分別為23.13±2.77 ng/mL、29.60±1.25ng/mL,Cytopore 2略高于Cytodex 3；尿素濃度峰值為0.88±0.06mmo

11、l/L,兩組間無明顯差異；明顯低于RCCS50ml培養(yǎng)。
　　 研究結(jié)論:
　　 RCMW與RCCS 50ml設(shè)計(jì)原理上存在巨大不同,從50ml到500ml并非簡單放大過程,50ml的成功培養(yǎng)不可復(fù)制到500ml。RCMW500ml存在設(shè)計(jì)上的嚴(yán)重缺陷,如不進(jìn)行改進(jìn),不適用于細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。
　　 第三部分 構(gòu)建大規(guī)模生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞的研究
　　 研究背景:
　　 RCMW500ml設(shè)計(jì)上存在嚴(yán)重

12、缺陷:1.水平方向的力無法平衡；2.物質(zhì)交換受到巨大限制,交換效率低下；3.系統(tǒng)中沒有氣體有效供應(yīng)和交換。這三個(gè)缺陷,極大地限制了RCMW500ml擴(kuò)增細(xì)胞的能力。即使對RCMW進(jìn)行改造,雖然可以改進(jìn)第2和第3點(diǎn)缺點(diǎn),但很難對第1點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)。由于液體推動(dòng)力始終在水平方向,RCWM500ml并不像設(shè)計(jì)者所宣稱的,細(xì)胞在其內(nèi)不受到任何單個(gè)矢量方向力的作用；而是不受重力作用,但受到持續(xù)的水平推力作用；不僅影響細(xì)胞的生長分化,甚至妨礙整個(gè)灌注系

13、統(tǒng)的正常運(yùn)行。
　　 因而,課題組決定,借鑒RCCS的設(shè)計(jì)原理,而避免RCMW的設(shè)計(jì)缺陷:將液體推動(dòng)力移至豎直方向,和重力互相抵消。在這一思路的指導(dǎo)下,本實(shí)驗(yàn)自行設(shè)計(jì)和構(gòu)建一個(gè)豎直方向上的灌注型微重力生物反應(yīng)器,并對其培養(yǎng)效果進(jìn)行了觀察。同時(shí),由于 RCMW 最可能的瓶頸因素是供氧,在新系統(tǒng)中,課題對比觀察了氧供對新系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)效果的影響。
　　 研究目的:
　　 構(gòu)建一個(gè)豎直方向上的灌注型微重力生物反應(yīng)器(ZH

14、J500),并進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
　　 研究方法:
　　 按照往復(fù)式生物反應(yīng)器、培養(yǎng)液池、膜肺、泵及動(dòng)力系統(tǒng)、加溫系統(tǒng)、供氣系統(tǒng)、控制系統(tǒng)構(gòu)建豎直方向灌注型微重力生物反應(yīng)器,并進(jìn)行安裝調(diào)試。調(diào)試完畢后,以Cytodex3為微載體,按照RCMW和RCCS 50ml培養(yǎng)條件進(jìn)行12d的CL-1細(xì)胞培養(yǎng)。對比觀察高氧組(55％氧氣)與20％氧組的培養(yǎng)效果,并設(shè)立空白對照組。實(shí)驗(yàn)連續(xù)觀察的指標(biāo)包括:細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞活力,上清

15、中ALT、AST、白蛋白和尿素的濃度。
　　 研究結(jié)果:
　　 肝細(xì)胞能夠在ZHJ500上生長。形態(tài)學(xué)觀察提示高氧組生長情況明顯好于20％氧組,而20％氧組生長情況略好于RCMW組。MTT染色提示高氧組活性較高。高氧組細(xì)胞密度達(dá)3.69±0.40*106個(gè)/ml；20％氧組也達(dá)到1.62±0.13*106個(gè)/ml；高于RCMW組；高氧組上清中白蛋白濃度峰值為135.53±7.55 ng/mL,20％氧組為31.71±4.