RCCS模擬微重力對(duì)小鼠肝Kupffer細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：我國(guó)載人航天工程已處于關(guān)鍵時(shí)期，要實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期駐留太空的目標(biāo)，維持航天員的健康、安全和高效的工作能力至關(guān)重要。失重是制約人類長(zhǎng)期駐留太空的主要因素，一方面失重使機(jī)體發(fā)生一系列生理病理變化，包括骨質(zhì)減少、肌肉萎縮、心血管紊亂和免疫功能低下等，另一方面失重會(huì)導(dǎo)致微生物生物學(xué)特性改變，多方面的因素增加了航天員患感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。肝臟是人體重要的生化代謝、解毒和免疫器官，枯否細(xì)胞（Kupffer Cells，KCs）是肝臟的巨噬細(xì)胞，是

2、全身單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的重要組成部分，具有吞噬、分泌和免疫功能，在全身尤其是肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。模擬微重力條件下肝KCs的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)（Rotary Cell Culture System，RCCS）作為微重力模型，探討失重對(duì)肝臟KCs的影響，旨在為當(dāng)前及今后載人航天飛行中出現(xiàn)的相關(guān)醫(yī)學(xué)問題提供對(duì)策思路和科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法：采用RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)建立小鼠肝KCs模擬微重力培養(yǎng)體系，將小

3、鼠肝原代KCs隨機(jī)分為模擬微重力（simulated microgravity，SMG）組和正常重力（normal gravity，NG）組，SMG組旋轉(zhuǎn)器軸心與地面平行，NG組回轉(zhuǎn)器軸心與地面垂直。倒置相差顯微鏡下觀察小鼠肝KCs的形態(tài)和生長(zhǎng)情況，于培養(yǎng)第3 d、5 d、7 d收獲細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠肝KCs的細(xì)胞周期，qPCR和Western Blotting技術(shù)分別檢測(cè)小鼠肝KCs的PCNA、Ki-67、E

4、RK、CDK2及Cyclin B基因和蛋白表達(dá)水平，掃描電鏡觀察小鼠肝KCs的表面結(jié)構(gòu)，透射電鏡觀察小鼠肝KCs超微結(jié)構(gòu)，激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠肝KCs細(xì)胞微絲骨架熒光強(qiáng)度的變化。
　　結(jié)果：細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，培養(yǎng)第3 d時(shí)SMG組明顯低于NG組（2.59±0.13 vs.3.10±0.15，P<0.05），培養(yǎng)第5 d、7 d時(shí)SMG組明顯高于NG組（6.92±0.35 vs.5.87±0.17，P<0.05；8.41±0.27

5、vs.6.54±0.26，P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)第3 d時(shí)SMG組G0/G1期明顯高于NG組（78.10±0.22 vs.59.69±1.19， P<0.05），S期、G2/M期明顯低于NG組（11.97±0.43 vs.27.63±0.88，P<0.05；9.93±0.27 vs.12.68±0.42，P<0.05）；培養(yǎng)第5 d時(shí)，SMG組G0/G1期低于NG組（69.52±1.48 vs.74.83±0.66

6、，P<0.05），S期、G2/M期高于NG組（21.18±1.47 vs.17.25±0.36，P<0.05；9.30±0.37 vs.7.92±0.38，P<0.05）；培養(yǎng)第7 d時(shí)，SMG組G0/G1期依然低于NG組(73.86±1.91 vs.81.70±1.29，P<0.05)，S期、G2/M期亦高于NG組（(18.88±1.94 vs.12.07±0.84，P<0.05；26±0.24 vs.6.23±0.55，P<0.05

7、)。qPCR結(jié)果顯示，與NG組相比，SMG組PCNA、Ki-67、ERK、CDK2以及Cyclin B基因表達(dá)在培養(yǎng)3 d時(shí)均下調(diào)，5 d和7 d時(shí)呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢(shì)。Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，小鼠肝KCs培養(yǎng)3 d時(shí)，與NG組相比較，SMG組的PCNA、Ki-67、p-ERK、CDK2以及Cyclin B1蛋白表達(dá)量均較低（P<0.05）；細(xì)胞培養(yǎng)5 d時(shí)，SMG組的PCNA、Ki-67、p-ERK、CDK2以及Cy

8、clin B1蛋白表達(dá)量高于NG組（P<0.05）；模擬微重力7 d時(shí)，PCNA、Ki-67、p-ERK、CDK2以及Cyclin B1蛋白表達(dá)量進(jìn)一步變化，蛋白表達(dá)量明顯高于 NG組（P<0.05）。掃描電鏡結(jié)果顯示，NG組和SMG組的小鼠肝KCs貼附在微載體上，細(xì)胞呈橢圓形或圓形或梭形，細(xì)胞表面有很多細(xì)胞突起，細(xì)胞與細(xì)胞之間相互連接聚集成團(tuán)，細(xì)胞伸出細(xì)細(xì)的偽足或傘形貼于微載體表面，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，微載體上貼附的細(xì)胞逐漸增多，尤其是第

9、7d微載體上的細(xì)胞最多，NG組與SMG組細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異。透射電鏡結(jié)果顯示，RCCS模擬微重力培養(yǎng)小鼠肝KCs5 d時(shí)，NG組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中度擴(kuò)張，線粒體固縮；SMG組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張外未見明顯異常；7 d時(shí)，NG組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張更加明顯，部分細(xì)胞線粒體腫脹、空化；SMG組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，線粒體出現(xiàn)固縮。激光共聚焦微絲熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示，小鼠肝KCs培養(yǎng)第3 d時(shí)， SMG組的熒光強(qiáng)度相對(duì)于NG組較弱，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NG組和S