模擬微重力下植物細(xì)胞生理及細(xì)胞電融合研究.pdf

1、細(xì)胞電融合技術(shù)是一門實(shí)用性很強(qiáng)的生物技術(shù)，也是空間發(fā)展的生物技術(shù)之一。上世紀(jì)70年代以來(lái)，利用電融合技術(shù)產(chǎn)生體細(xì)胞雜種植株已有不少報(bào)道，但由于雜種細(xì)胞融合率較低，使得這項(xiàng)技術(shù)在生產(chǎn)上的應(yīng)用潛力難以發(fā)揮，而空間微重力環(huán)境沒(méi)有重力沉降和熱對(duì)流等因素影響，使得雜種細(xì)胞融合率及活力率均有所提高，然而空間搭載成本較高，受到飛行時(shí)間和儀器重量的限制，試驗(yàn)不能多次重復(fù)，因此常采用模擬回轉(zhuǎn)器旋轉(zhuǎn)進(jìn)行模擬失重的生物研究。目前微重力模擬試驗(yàn)主要集中于動(dòng)物細(xì)

2、胞、藻類細(xì)胞及對(duì)植物整個(gè)植株和種子的研究上，直接對(duì)植物細(xì)胞回轉(zhuǎn)的研究較少。本試驗(yàn)采用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置(RCCS)模擬微重力條件，對(duì)去除細(xì)胞壁的植物原生質(zhì)體進(jìn)行模擬微重力回轉(zhuǎn)，觀察模擬失重對(duì)原生質(zhì)體狀態(tài)、細(xì)胞層面上各種生理生化指標(biāo)及自體電融合的影響，為微重力條件下植物細(xì)胞電融合機(jī)理提供理論參考。 本論文主要分為三個(gè)部分： 一、采用曼陀羅(Datura metel L．)莖段為外植體，在附加不同植物激素組合的培養(yǎng)基中對(duì)愈傷組

3、織的誘導(dǎo)和植株再生進(jìn)行研究。結(jié)果表明：采用修改的MS培養(yǎng)基(除去甘氨酸，維生素B1含量增加至0.5mg/L，pH 5.5)附加2 mg/L，2,4-D可由曼陀羅莖段誘導(dǎo)大量胚性愈傷組織；愈傷組織繼代選用0.5 mg/L2,4-D為宜；不定芽的誘導(dǎo)采用MS培養(yǎng)基(20 g蔗糖，8 g瓊脂，0.1g水解干酪素)+6-BA(0.5 mg/L)；幼苗進(jìn)一步轉(zhuǎn)接至1/2 MS+IBA(0.2 mg/L)生根培養(yǎng)基中，可完成曼陀羅莖段愈傷組織誘導(dǎo)和

4、再生植株的組織培養(yǎng)過(guò)程。 二、分別以煙草無(wú)菌苗(Nicotiana tabacum cv．Wisconsin 38)葉片，煙草懸浮系(T-BY-2)，曼陀羅愈傷組織為材料分離制備原生質(zhì)體，并采用不同染料對(duì)原生質(zhì)體活力和細(xì)胞核進(jìn)行染色效果比較。結(jié)果表明：由煙草懸浮系得到的原生質(zhì)體數(shù)量多、活力旺盛、耐受力好，更適合于模擬微重力試驗(yàn)；原生質(zhì)體活力觀察宜采用熒光素雙醋酸酯(FDA)染色法，染色效果清晰，四嘧唑藍(lán)(MTT)法則可定量反映

5、原生質(zhì)體活力；相對(duì)于其他細(xì)胞核染料，DAPI對(duì)不同來(lái)源的原生質(zhì)體細(xì)胞核染色效果均較好，能夠清晰地對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。 三、選用煙草懸浮系(T-BY-2)原生質(zhì)體為材料對(duì)模擬失重下煙草原生質(zhì)體生理及自體電融合變化進(jìn)行探討。結(jié)果表明：煙草懸浮系原生質(zhì)體模擬失重以15 rpm的回轉(zhuǎn)速度較為適宜，回轉(zhuǎn)后大部分煙草懸浮系原生質(zhì)體形態(tài)未發(fā)生變化，少部分原生質(zhì)體細(xì)胞質(zhì)和液泡發(fā)生分離；與正常地面對(duì)照組相比原生質(zhì)體活力有所下降；模擬失重下

6、原生質(zhì)體可再生細(xì)胞壁，與地面對(duì)照無(wú)明顯差異；模擬回轉(zhuǎn)初期煙草原生質(zhì)體輔酶Ⅰ(NADH)含量高于地面對(duì)照組，隨著時(shí)間延長(zhǎng)NADH含量逐漸降低，均低于地面對(duì)照組，表明模擬微重力條件下煙草原生質(zhì)體所需能量減少；另外模擬回轉(zhuǎn)初期煙草原生質(zhì)體微絲骨架解聚，F(xiàn)-actin含量低于地面對(duì)照，隨著時(shí)間延長(zhǎng)回轉(zhuǎn)組微絲骨架含量逐漸恢復(fù)，與對(duì)照組F-actin含量相當(dāng)，回轉(zhuǎn)24 h后原生質(zhì)體F-actin含量反高于地面對(duì)照，具體原因還需進(jìn)一步探討；最后本試驗(yàn)