復(fù)方阿膠漿對(duì)貧血的治療作用及作用機(jī)制的研究.pdf

1、貧血是臨床上最為常見的癥狀之一，可以并發(fā)于很多疾病。在2010年，全世界約有32.9％的人患有不同程度的貧血，且每年有上千萬(wàn)人由于貧血所引致的各類疾病而死亡。因此，對(duì)貧血的治療非常重要。復(fù)方阿膠漿(FEJ)作為一種知名的復(fù)方中藥，在臨床上主要用于補(bǔ)氣補(bǔ)血，其確切的補(bǔ)血療效逐漸受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。近年來(lái)，雖然在動(dòng)物模型和臨床應(yīng)用方面關(guān)于FEJ治療貧血的研究均取得了一定的進(jìn)展，但是這些研究大部分都只是大體上觀察FEJ治療貧血的效果，沒有

2、對(duì)其抗貧血活性進(jìn)行特別深入和系統(tǒng)的研究，更沒有對(duì)FEJ糾正貧血的作用機(jī)制進(jìn)行相關(guān)的研究，這極大地限制了FEJ進(jìn)一步的開發(fā)和應(yīng)用。因此，在以往相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，我們通過(guò)建立3種常見貧血類型的動(dòng)物模型，即腎性貧血、缺鐵性貧血、骨髓抑制貧血模型，經(jīng)過(guò)FEJ給藥治療后，采用現(xiàn)代藥理學(xué)的技術(shù)和手段，以進(jìn)一步觀察FEJ糾正貧血的藥理作用，同時(shí)從現(xiàn)代生物學(xué)角度在分子水平探究其相關(guān)的作用機(jī)制。本課題的主要研究?jī)?nèi)容包括以下3個(gè)方面。
　　1.FEJ

3、對(duì)腎性貧血大鼠的治療作用及作用機(jī)制
　　采用灌胃腺嘌呤的方法制備腎性貧血大鼠模型。模型制備成功后，動(dòng)物隨機(jī)分為8組:空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，低、中、高劑量FEJ(3、6、12mL/kg·d)組，促紅細(xì)胞生成素(EPO，每3d200U/kg)陽(yáng)性對(duì)照組，阿膠(300mg/kg·d)組和無(wú)阿膠復(fù)方阿膠漿(WEFF，即FEJ中除阿膠外的所有其他組分，6mL/kg·d)組。連續(xù)給藥24d后，按照常規(guī)方法檢測(cè)各組大鼠外周血紅細(xì)胞(RBC)計(jì)

4、數(shù)、血紅蛋白(Hb)含量、紅細(xì)胞壓積(Hct)和血清中血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、EPO、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的含量以及紅細(xì)胞脆性。采用HE染色的方法觀察腎臟組織病理形態(tài)，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)腎皮質(zhì)EPO和骨髓有核細(xì)胞(BMNC)中EPO受體(EPOR)的mRNA水平。
　　結(jié)果顯示，中、高劑量FEJ均可以顯著升高外周血RBC、Hb、Hct水平，

5、顯著降低BUN、Scr含量，顯著升高血清SOD、GSH和GSH-Px的含量(P＜0.05)，同時(shí)有升高血清EPO含量的趨勢(shì)。低、中、高劑量FEJ都可以顯著降低紅細(xì)胞溶解率(P＜0.05)。中、高劑量FEJ能夠明顯改善腎臟組織病理狀態(tài)，同時(shí)顯著上調(diào)腎皮質(zhì)EPO和BMNC中EPORmRNA水平(P＜0.05)。此外，阿膠能夠顯著升高模型大鼠血清中SOD、GSH-Px的含量和骨髓有核細(xì)胞EPORmRNA水平，WEFF能夠顯著升高GSH含量，顯

6、著降低紅細(xì)胞溶解率(P＜0.05)。
　　這些結(jié)果表明，F(xiàn)EJ能夠在整體上有效治療腎性貧血大鼠。它是通過(guò)多因素、多途徑、多靶點(diǎn)的綜合性的整體效應(yīng)來(lái)發(fā)揮治療作用的，同時(shí)在這個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)EJ中阿膠組分和WEFF組分具有互補(bǔ)作用。FEJ治療腎性貧血可能的作用機(jī)制是:①增強(qiáng)體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)的功能，清除多余自由基;延緩腎臟病變的進(jìn)程，減輕腎臟損傷程度;降低紅細(xì)胞脆性，延長(zhǎng)紅細(xì)胞壽命;②上調(diào)腎皮質(zhì)EPOmRNA和BMNC中EPORmRNA的

7、水平，同時(shí)可能促進(jìn)了體內(nèi)EPO的表達(dá)，增強(qiáng)骨髓紅系造血功能。這兩個(gè)因素又相互聯(lián)系、相輔相成，從而形成了一個(gè)良性循環(huán)，最終在整體上改善腎性貧血。
　　2.FEJ對(duì)缺鐵性貧血大鼠的治療作用及作用機(jī)制
　　采用低鐵飼料喂飼并輔以少量放血的方法建立缺鐵性貧血大鼠模型。建模成功后，所有動(dòng)物隨機(jī)分為11組:空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，F(xiàn)EJ（5mL/kg·d）組，F(xiàn)eSO4（10mg/kg·d鐵元素）組，低、中、高劑量FEJ(2.5、5、1

8、0mL/kg·d)與鐵劑聯(lián)合給藥組，阿膠(250mg/kg·d)組，阿膠與鐵劑聯(lián)合給藥組，WEFF(5mL/kg·d)組，WEFF與鐵劑聯(lián)合給藥組。連續(xù)給藥21d后，采用原子吸收分光光度法檢測(cè)FEJ、50mg/mL阿膠溶液、WEFF中的鐵含量;采用常規(guī)方法檢測(cè)各組大鼠外周血RBC計(jì)數(shù)、Hb含量、Hct，及其心臟、脾臟、肝臟系數(shù);采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)各組大鼠血清鐵(SI)、血清鐵蛋白(SF)、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白（sTRF）、

9、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(sTfR)、血清EPO含量;采用RT-PCR的方法檢測(cè)各組大鼠十二指腸中二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(DMT-1)、金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（MTP-1）、亞鐵氧化酶(Hp)mRNA的水平和肝臟中hepcidinmRNA的水平。
　　結(jié)果顯示，F(xiàn)EJ、50mg/mL阿膠溶液、WEFF中的鐵含量分別為:108.871μg/ml、0.496μg/ml、46.115μg/ml。FEJ、FeSO4、3種劑量FEJ與鐵劑聯(lián)合給藥均能夠顯著升

10、高模型大鼠外周血中RBC計(jì)數(shù)、Hb和Hct水平;顯著降低其心臟系數(shù)和脾臟系數(shù)，升高肝臟系數(shù)(P＜0.05);顯著升高SI含量，降低sTRF、sTfR含量(P＜0.05)。其中，F(xiàn)EJ與鐵劑聯(lián)合給藥對(duì)模型大鼠的治療效果最好，鐵劑的治療效果又優(yōu)于FEJ，F(xiàn)EJ的治療效果比單用阿膠和單用WEFF都要好。在3種不同劑量FEJ與鐵劑聯(lián)合用藥組中，隨著FEJ劑量的增加，SI含量有升高的趨勢(shì)，SF含量有降低的趨勢(shì)。在高劑量FEJ與鐵劑聯(lián)合給藥組和WE

11、FF組兩組中，其十二指腸中DMT-1、MTP-1、HpmRNA水平明顯高于其他給藥組。
　　這些結(jié)果表明，F(xiàn)EJ能夠在一定程度上改善缺鐵性貧血，但不如鐵劑治療效果好，且在治療缺鐵性貧血時(shí)與鐵劑聯(lián)用可能具有協(xié)同作用。FEJ治療缺鐵性貧血的作用很大程度上可能是通過(guò)促進(jìn)鐵的吸收和利用（生成血紅蛋白）來(lái)實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)在這個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)EJ中阿膠組分和WEFF組分具有互補(bǔ)作用。其具體的機(jī)制可能是FEJ除了能提供極少量的鐵元素之外，還可以上調(diào)十二

12、指腸中與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的DMT-1、MTP-1、Hp這3種基因mRNA的水平，促進(jìn)缺鐵性貧血?jiǎng)游镌谑改c部位對(duì)鐵的吸收;同時(shí)能夠降低鐵蛋白（儲(chǔ)存鐵）含量，且提高SI和sTRF的含量，進(jìn)而增加進(jìn)入骨髓中原始紅系細(xì)胞的鐵的量，最終促進(jìn)血紅蛋白的合成及紅細(xì)胞的生成。
　　3.FEJ對(duì)骨髓抑制貧血小鼠的治療作用及作用機(jī)制
　　采用照射60Coγ射線、腹腔注射環(huán)磷酰胺和氯霉素的方法制備骨髓抑制貧血模型。造模后，所有動(dòng)物共分為7組，分別為

13、:空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，低、中、高劑量FEJ(5、10、20mL/kg·d)組，阿膠(500mg/kg·d)組，WEFF(10mL/kg·d)組。連續(xù)給藥10d后，采用常規(guī)方法檢測(cè)各組小鼠外周血RBC計(jì)數(shù)、白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)、血小板(PLT)計(jì)數(shù)、Hb含量、BMNC的數(shù)量和胸腺、脾臟系數(shù);采用甲基纖維素培養(yǎng)基體外培養(yǎng)的方法對(duì)紅系集落形成單位(CFU-E)、紅系爆式集落形成單位(BFU-E)、粒-單核系祖細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM

14、)和成纖維細(xì)胞集落形成單位(CFU-F)進(jìn)行計(jì)數(shù);采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMNC中造血干細(xì)胞(HSC)的比例、BMNC細(xì)胞周期和凋亡情況;采用HE染色的方法觀察股骨骨髓組織病理形態(tài);采用ELISA的方法檢測(cè)各組小鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素-3(IL-3)、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、EPO的含量;采用RT-PCR的方法檢測(cè)脾臟中IL-1β、

15、IL-3、IL-6mRNA的水平。此外，在體外用不同濃度的FEJ(2.5、5、10μL/mL)、阿膠（250μg/mL）、WEFF（5μL/mL）處理培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)48h后，用ELISA的方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中GM-CSF、IL-6、干細(xì)胞因子(SCF)的含量，用RT-PCR的方法檢測(cè)BMSC中GM-CSF、IL-6、SCFmRNA的水平。
　　結(jié)果顯示，中、高劑量FEJ能夠顯著升高模型小鼠外周血中WBC計(jì)數(shù)、RBC

16、計(jì)數(shù)、Hb含量及BMNC的數(shù)量;顯著增加貧血小鼠的體重和胸腺、脾臟系數(shù);顯著增加CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CUF-F集落的計(jì)數(shù)(P＜0.05)，顯著改善骨髓組織病理狀態(tài)。高劑量FEJ能夠顯著提高模型小鼠BMNC中HSC的比例，增加進(jìn)入S期、G2/M期的骨髓細(xì)胞的比例，抑制BMNC中晚期凋亡細(xì)胞和總凋亡細(xì)胞的比例(P＜0.05)。中、高劑量FEJ能夠顯著升高模型小鼠血清中GM-CSF、IL-3含量和脾臟中IL-1β、IL-3m

17、RNA水平（P＜0.05）;高劑量FEJ還能夠顯著降低血清中TGF-β含量(P＜0.05)。在體外實(shí)驗(yàn)中，中、高劑量FEJ能夠在體外顯著增加BMSC分泌SCF、GM-CSF的量和BMSC中SCF、GM-CSFmRNA水平(P＜0.05);高劑量FEJ還能夠顯著增加BMSC分泌IL-6的量和BMSC中IL-6mRNA水平(P＜0.05)。此外，阿膠對(duì)血常規(guī)、BMNC數(shù)量、造血祖細(xì)胞和CFU-F的計(jì)數(shù)、血清中造血相關(guān)細(xì)胞因子含量以及在體外對(duì)

18、BMSC表達(dá)造血相關(guān)細(xì)胞因子等指標(biāo)的改善情況與中劑量FEJ非常接近，但效果不如中劑量FEJ。在WEFF組中，BMNC的增殖指數(shù)顯著升高(P＜0.05)。
　　這些結(jié)果表明，F(xiàn)EJ對(duì)于骨髓抑制貧血小鼠具有較好的治療作用，在整體水平上明顯改善了骨髓抑制的狀態(tài)，增強(qiáng)骨髓的造血功能，同時(shí)在這個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)EJ中阿膠組分和WEFF組分具有互補(bǔ)作用。FEJ促進(jìn)模型小鼠造血功能恢復(fù)可能的作用機(jī)制主要有如下3種:①增強(qiáng)CFU-F的形成能力、改善骨髓