藥用三萜酸細(xì)胞工廠的構(gòu)建.pdf

1、樺木酸、齊墩果酸等三萜酸類(lèi)化合物具有抗腫瘤、抗HIV、保肝等多種藥理活性，已被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療保健領(lǐng)域。從天然植物直接提取或化學(xué)合成三萜酸類(lèi)化合物的方法存在破壞生態(tài)環(huán)境、收率低、高能耗等問(wèn)題。近年來(lái)，微生物發(fā)酵法因成本低、環(huán)境友好而備受關(guān)注。釀酒酵母為安全的模式生物，具有遺傳背景清晰，遺傳操作簡(jiǎn)單及大規(guī)模發(fā)酵技術(shù)成熟等優(yōu)勢(shì)，利用重組釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)植物源天然藥物已成為微生物發(fā)酵法的研究熱點(diǎn)。
　　為獲得生產(chǎn)樺木酸的釀酒酵母細(xì)胞工廠

2、，本研究首先在三萜底盤(pán)細(xì)胞BY-T3的rDNA多拷貝位點(diǎn)引入烏拉爾甘草來(lái)源的羽扇豆醇合酶基因（LUP）及MVA途徑限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（tHMG1），初步獲得了可生產(chǎn)樺木酸前體羽扇豆醇的底盤(pán)細(xì)胞BY-LUP02，其在YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵6天后，羽扇豆醇產(chǎn)量可達(dá)到117.4 mg/L。在此基礎(chǔ)上，本研究分別組合擬南芥來(lái)源細(xì)胞色素P450還原酶1(AtCPR1)及3種不同來(lái)源的細(xì)胞色素P450酶，篩選得到了催化活性最

3、高的葡萄來(lái)源的P450酶(CYP15)。為進(jìn)一步提高工程菌株的樺木酸產(chǎn)量，本研究篩選了7種不同來(lái)源的細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)，得到了效果最佳的擬南芥來(lái)源細(xì)胞色素P450還原酶2(AtCPR2)，最終獲得了一個(gè)高產(chǎn)樺木酸的細(xì)胞工廠BY-BA42(12.7 mg/L)。
　　在前期研究中，實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功構(gòu)建出生產(chǎn)齊墩果酸的釀酒酵母細(xì)胞工廠BY-OA，但經(jīng)代謝物分析發(fā)現(xiàn)前體物質(zhì)鯊烯還有很高的積累(141.2 mg/L)。為進(jìn)一步

4、提高鯊烯轉(zhuǎn)化為齊墩果酸的能力，本研究在BY-OA的基礎(chǔ)上增加下游關(guān)鍵基因（光果甘草β-香樹(shù)脂合成酶GgbAS，蒺藜狀苜蓿齊墩果酸合成酶MtOAS和AtCPR1）拷貝數(shù)后得到的第二代齊墩果酸工程菌株BY-2OA，其在含初始葡萄糖濃度為20 g/L的YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵7天后，β-香樹(shù)脂和齊墩果酸產(chǎn)量分別提高54％和30％，達(dá)到136.5 mg/L和92.5 mg/L;通過(guò)進(jìn)一步碳源優(yōu)化，BY-2OA在初始葡萄糖濃度為40 g/L的YPD培養(yǎng)