過度訓練大鼠腎組織熱休克蛋白70的表達及山莨菪堿干預的研究.pdf

1、目的：近年來對過度訓練引起的急性腎損傷(overtraining-inducedacute kidney injury，OTIAKI)的研究越來越多，因為它已成為危害人類健康的重要疾病，但其發(fā)病機制和損傷方式尚不清楚，目前尚缺乏有效的防治方法。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)又稱應激蛋白，它是細胞應激反應的生物標志及內(nèi)源性保護蛋白，其表達的強弱與組織細胞的損害程度有關(guān)。其中熱休克蛋白70(heat shoc

2、k protein70，HSP70)在生物細胞中含量最高，受到誘導最強，應激后生成最顯著，具有多種生物學功能，對細胞有明確的內(nèi)源性保護作用。本研究采取大鼠無負重單次游泳至力竭建立過度訓練引起的急性腎損傷的模型，研究過度訓練大鼠腎組織細胞HSP70的表達規(guī)律及其與腎組織細胞凋亡的關(guān)系，并觀察山莨菪堿對HSP70表達的影響，探討其作用機制。
　　方法：
　　(1)清潔級雄性SD大鼠48只，體重180—220g，按隨機數(shù)字表隨機分

3、為三組：安靜對照組(CN，n=8)、力竭運動組(ES，n=24)、山莨菪堿干預組(AD，n=16)。安靜對照組(CN)未進行力竭運動，不注射任何藥物；力竭組又根據(jù)力竭后恢復時間不同分為力竭后即刻組(ESI)、力竭后6小時組(ES6h)和力竭后24小時組(ES24h)三個亞組，且各亞組大鼠在運動前20min給予滅菌注射用水10mg/Kg一次性腹腔注射；山莨菪堿干預組也根據(jù)力竭后恢復時間不同分為山莨菪堿6h組(AD6h)和山莨菪堿24h組(

4、AD24h)兩個亞組，各亞組大鼠于運動前20min給予山莨菪堿注射液10mg/Kg一次性腹腔注射。每個時間點均為8只大鼠。采用大鼠無負重單次游泳至力竭建立過度訓練引起急性腎損傷模型。
　　(2)于各時間點，5％的水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，摘取兩側(cè)腎臟，將左側(cè)腎臟放入EP管，迅速放入液氮中，-80℃冰凍保存，待用于Western blot技術(shù)檢測腎組織HSP70的表達。右側(cè)腎臟置于4℃4％多聚甲醛中固定，制作石蠟切片。<

5、br>　　(3)采用HE染色光鏡下觀察腎組織病理形態(tài)學變化。
　　(4)采用免疫組化染色(PV法)觀察腎組織HSP70的表達情況，并應用圖像分析系統(tǒng)對免疫組化結(jié)果進行半定量分析。
　　(5)應用Western blot技術(shù)檢測腎組織HSP70表達的變化。
　　(6)統(tǒng)計分析：所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標準差(-X±S)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way AN

6、OVA)分析，以P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　(1)無負重單次游泳至力竭后大鼠表現(xiàn)為極度疲勞的神態(tài)，精神萎靡，對外界刺激反應遲鈍，胸腹著地，無法站立，活動困難，嚴重者可有球結(jié)膜出血的現(xiàn)象。力竭運動組大鼠約2h后方可自由活動，進食水情況欠佳，而山莨菪堿干預組大鼠約20min后可自由活動，基本可正常進食。
　　(2)正常對照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)無明顯變化。力竭后即刻組、力竭后6h組腎組織結(jié)構(gòu)改變輕微，有部分腎

7、小球囊、腎小管擴張，近端腎小管上皮細胞水腫，出現(xiàn)空泡變性；力竭后24h組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)改變明顯，在皮髓質(zhì)交界處及髓質(zhì)可見大量細胞的細胞核深染及固縮現(xiàn)象，間質(zhì)可見浸潤細胞，腎小管上皮細胞的刷狀緣出現(xiàn)不規(guī)整甚至脫落的改變。山莨菪堿6h組及山莨菪堿24h組較同期單純力竭組比較大鼠腎組織結(jié)構(gòu)改變明顯減輕。
　　(3)免疫組化染色檢測腎組織HSP70的表達：陽性細胞多為腎小管上皮細胞，腎小球幾乎無表達，且腎髓質(zhì)中的細胞表達強于腎皮質(zhì)。正常對

8、照組大鼠腎組織中有較弱的HSP70的表達。力竭運動組大鼠隨恢復時間的延長，腎組織HSP70蛋白的表達水平呈逐漸增高趨勢，且同正常對照組相比均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。山莨菪堿干預組大鼠腎組織中HSP70的表達較同期力竭組比較陽性細胞數(shù)增加，且表達強度明顯增強(P<0.05)。
　　(4)Western blot技術(shù)檢測腎組織HSP70的表達：在內(nèi)參GAPDH表達量基本一致的情況下，與正常對照組比較，隨恢復時間的延長，力竭運動組

9、腎組織HSP70表達逐漸增強(P<0.05)。山莨菪堿6h組、山莨菪堿24h組較同期力竭組比較，腎組織HSP70表達增強(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)HSP70在過度訓練大鼠腎組織中表達增強，且于力竭后即刻至力竭后24小時呈逐漸增高趨勢，用免疫組化法觀察腎髓質(zhì)中的細胞表達強于腎皮質(zhì)。
　　(2)山莨菪堿干預組與同期力竭組比較，腎組織損傷減輕，腎組織HSP70的表達增強，山莨菪堿對OTIAKI的保護作用有可能