preS1分子連接體轉(zhuǎn)運siHBX抑制HepG2-HBX細胞株內(nèi)HBX基因表達的實驗研究.pdf

1、乙型肝炎病毒感染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題,慢性乙型肝炎常常發(fā)展為肝硬化、肝癌甚至肝衰竭。肝細胞肝癌(HCC)患者中乙型肝炎病毒(HBV)感染率高達50％～80%,其中HBX蛋白在HBV致癌過程中發(fā)揮了重要作用。目前治療HBV感染主要采用干擾素及核酸類似物,但存在副作用大、病毒變異逃逸等問題,因此,新的治療手段和新藥開發(fā)具有重要意義。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)作為一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默手段已經(jīng)在

2、腫瘤、慢性疾病及感染性疾病的治療中顯示出巨大潛力及應(yīng)用前景;目前認為siRNA臨床應(yīng)用中最主要的瓶頸在于其穩(wěn)定性較低并缺乏有效的靶向轉(zhuǎn)運策略。常用于轉(zhuǎn)運siRNA的系統(tǒng)主要有納米載體(nanocarrier)和分子連接體(molecular conjugate)兩類。分子連接體多采用靶向性配體及穿透性多肽策略。
　　 HBV表面蛋白包含大蛋白(L)、中蛋白(M)、小蛋白(S),三者均具有S結(jié)構(gòu)域,M蛋白較S蛋白多出55個氨基酸的

3、preS2區(qū)域,而最外面的L蛋白較M蛋白又多出108或119個氨基酸的preS1區(qū)域。HBV侵入肝細胞的過程尚未徹底清楚,其特異性受體尚無明確結(jié)論。
　　 但相關(guān)的研究均表明preS1可能是病毒與細胞膜上特異性受體結(jié)合并攜帶病毒基因組進入細胞內(nèi)的配體;而preS1與受體結(jié)合的區(qū)域主要在其N端,其中21-47aa多肽片斷被證實起關(guān)鍵性作用。
　　 目的:本實驗旨在成功構(gòu)建HepG2-HBX穩(wěn)定表達株的基礎(chǔ)上,驗證preSl

4、連接體特異轉(zhuǎn)運siRNA進入細胞內(nèi)進行RNA干擾的能力,為乙型肝炎病毒及肝癌的治療及預(yù)防提供新的探索。而目前國內(nèi)外尚無相關(guān)實驗報道。
　　 方法:本課題以HBV病毒中的X基因為RNA干擾對象;用脂質(zhì)體將含有HBX序列的真核表達質(zhì)粒pCDNA3.1(+)/HBX-Flag轉(zhuǎn)染入HepG2細胞系,通過G418篩選后分別經(jīng)RT-PCR和免疫組化,對HBX的穩(wěn)定表達進行驗證;化學(xué)合成靶向HBX的siRNA(即siHBX),用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進

5、入HepG2-HBX細胞株,分別以RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測HBX mRNA表達水平變化,Western Blot檢測HBX蛋白表達水平差異。在驗證HBX穩(wěn)定表達及siHBX有效性的基礎(chǔ)上,化學(xué)合成pres1分子連接體,pres1分子連接體分別與肝細胞系與siRNA進行結(jié)合能力試驗,然后以preS1分子連接體作為轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)染siHBX入HepG2-HBX后經(jīng)實時熒光RT-PCR及Western Blot檢測siHBX對H

6、BX基因的抑制效果。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染篩選試驗結(jié)果顯示HBX轉(zhuǎn)染成功;進一步的RT-PCR和免疫組化結(jié)果提示19號陽性克隆高水平穩(wěn)定表達HBX基因。siHBX作用HepG2-HBX細胞系后36h和72h后對HBX mRNA的抑制率分別為85.37%±3.02%和58.05%±4.00%,而非特異性對照sirNA對HBXmRNA的抑制率分別2.11%±0.04%和1.02%±0.05%;免疫印跡實驗及細胞流式檢測驗顯示siHBX能

7、夠抑制HBX蛋白及細胞周期進展。
　　 進一步凝膠電泳遷移試驗(EMSA)證實preS1分子連接體能夠與siRNA進行有效結(jié)合(摩爾比10:1),同時可以攜帶siRNA進入肝細胞內(nèi)高效抑制HepG2-HBX細胞株內(nèi)HBX的表達。與空白組相比,非特異陰性對照組抑制率為11.944±6.3%,而陽性對照組(脂質(zhì)體)及實驗組(preS1分子連接體)的抑制率分別為85.24±2.6%和77.80±6.10%。
　　 結(jié)論:上述結(jié)