HBx抑制RASSF1A表達參與肝癌發(fā)生可能機制的研究.pdf

1、目的:分析肝癌組織中RASSF1A的表達趨勢及乙肝病毒（Hepatitis BVirus，HBV）的關鍵基因HBx對RASSF1A的表達影響。
　　方法:應用RT-PCR（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）和實時熒光定量RT-PCR(Fluorescent Quantitative RT-PCR)方法，在RNA水平分析了肝癌病例組織、正常肝永生化細胞系和肝

2、癌細胞系中抑癌基因RASSF1A的表達情況。應用免疫組織化學(Immunohistochemistry，IHC)方法分析了RASSF1A在細胞中的表達部位。在HBx表達載體轉染的正常肝永生化細胞系L02、肝癌癌旁細胞系QSG-7701和肝癌細胞系SMMC-7721中，應用RT-PCR方法檢測了RASSF1A在HBx轉染前后的表達變化。以DNA甲基轉移酶抑制劑5'-Aza處理表達HBx的肝癌細胞系MHCC-97H，檢測DNA甲基化作用是否

3、參與調控了RASSF1A的表達。運用甲基化特異性PCR(Methylated Specific PCR，MSP)方法檢測了HBx轉染前后L02和QSG-7701細胞系RASSF1A基因的啟動子區(qū)DNA甲基化情況。用RT-PCR的方法檢測了穩(wěn)定轉染DNMT1 siRNA和DNMT3B siRNA的肝癌細胞系SMMC-7721中RASSF1A的表達情況，以確認何種DNA甲基轉移酶了參與了RASSF1A的表達調控。應用亞硫酸氫鹽基因組測序法(

4、Bisulfite Genomic Sequencing，BGS)分析抑制DNMT1后RASSF1A啟動子區(qū)CpG位點的DNA甲基化程度。
　　結果: RASSF1A在肝癌組織和肝癌細胞系中呈表達下調趨勢。在肝癌組織中，RASSF1A在RNA水平的低表達率為48％。免疫組織化學的結果顯示，RASSF1A在肝細胞核中表達。在轉染了HBx表達載體的正常肝永生化細胞系L02，肝癌癌旁細胞系QSG-7701和肝癌細胞系SMMC-7721中

5、，HBx的轉染下調了RASSF1A的表達，同時，DNMT1和DNMT3B表達上升。以5'-Aza處理表達HBx的細胞系MHCC-97H，RASSF1A的表達回復，提示DNA甲基化參與調節(jié)RASSF1A的表達。HBx轉染沒有改變RASSF1A啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)，但影響了個別CpG位點的甲基化程度。HBx上調了肝癌細胞中DNMT1和DNMT3B，而抑制DNMT1誘導了RASSF1A表達，提示HBx抑制RASSF1A的表達可能與DNMT