胞質(zhì)轉(zhuǎn)移的Ku70-80復合物識別HBV DNA誘導產(chǎn)生炎性相關趨化因子.pdf

1、乙肝病毒(HBV)感染引起的乙型肝炎，是一個全球性的健康問題，世界各地約有3500萬慢性乙肝病毒感染者，嚴重地威脅患者生命安全。隨著研究的不斷深入，我們發(fā)現(xiàn)當慢性乙肝患者出現(xiàn)肝炎癥狀時，表明機體的免疫系統(tǒng)對體內(nèi)所存在的含有HBV快速復制的肝細胞產(chǎn)生免疫反應，其中HBV特異性CD8+T細胞作為主要的效應細胞起著關鍵性的作用，NK細胞，NKT細胞和其他免疫相關的細胞也發(fā)揮著一定的作用。然而，這些細胞是如何招募到發(fā)病部位從而行使功能的機制仍不

2、清楚，這也是我們關心的問題，通過體內(nèi)外實驗以及所獲得的數(shù)據(jù)分析，我們得出以下幾方面結(jié)果:
　　1.通過使用Gene Expression Omnibus(GEO)網(wǎng)站，對不同的乙型肝炎相關基因芯片數(shù)據(jù)進行分析，我們觀察到在乙肝病毒感染引起炎癥的患者肝組織中，趨化因子的差異程度和表達上的相對值和絕對值，變化都非常的明顯。并且在接受抗病毒治療的乙肝患者血清中，我們也檢測到隨著患者病情的減輕，病毒滴度的降低，趨化因子CCL5的含量也顯著

3、降低。這一結(jié)果預示著趨化因子CCL5在乙型肝炎中，可能扮演非常重要的角色。
　　2.利用Ad-HBV感染的小鼠模型，我們發(fā)現(xiàn)Ad-HBV感染會導致小鼠肝臟中炎性趨化因子CCL3和CCL5的表達上調(diào)，同時伴隨著大量淋巴細胞的浸潤和血清中ALT水平的升高。結(jié)合文獻報道其配體CCR5在乙型肝炎中的重要作用，推測CCL3和CCL5可能是招募淋巴細胞到達肝臟的關鍵性趨化因子。
　　3.HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝臟來源細胞系，發(fā)現(xiàn)肝實質(zhì)來源的細胞

4、系無法產(chǎn)生趨化因子，而肝臟內(nèi)皮來源的細胞中可以產(chǎn)生大量趨化因子。由于肝實質(zhì)細胞中，乙肝病毒可以復制，文獻報道表明乙肝病復制產(chǎn)物，會抑制細胞內(nèi)天然免疫相關的信號通路。所以我們推測肝臟中的趨化因子來源可能不是肝實質(zhì)細胞，而是內(nèi)皮細胞。
　　4.我們對HBV DNA進行標記后，轉(zhuǎn)染細胞，并拉下DNA結(jié)合蛋白。質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示，Ku70/80分子能夠結(jié)合HBV DNA。Ku70/80復合物是已知的DNA識別受體，可以識別細胞內(nèi)的多種DNA

5、分子。在HepG2.2.15細胞中，我們也觀察到Ku70/80分子與HBcAg形成共定位，暗示其可能識別HBV DNA分子。對Ku70分子干擾后，細胞表達趨化因子CCL3和CCL5的水平會大幅降低。
　　5.對轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒的細胞進行Ku70分子的免疫共沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)PARP1分子可以結(jié)合Ku70/80復合物。免疫熒光結(jié)果也顯示，PARP1可以與Ku70/80復合物在胞質(zhì)中形成共定位。干擾PARP1的表達，同樣抑制趨化因子的上調(diào)。

6、說明PARP1確實參與Ku70/80識別HBV DNA，促進趨化因子產(chǎn)生的信號通路。同時我們還發(fā)現(xiàn)，這條通路的下游的IRF1分子，在細胞受到HBV DNA刺激后，IRF1與Ku70/80復合物在胞質(zhì)中形成共定位，并且出現(xiàn)入核現(xiàn)象。
　　通過以上五方面的實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了一條由Ku70/80識別HBV DNA介導的，通過PARP1和IRF1誘導炎性趨化因子CCL3，CCL5上調(diào)的信號通路?；虮磉_芯片結(jié)果顯示，產(chǎn)生的趨化因子CCL