DNA復制叉重啟相關蛋白DnaT-ssDNA復合物結構和功能研究.pdf

1、生物進化過程中，為了適應不同的功能需要，演變出多種具有不同結構特征和可以識別并結合ssDNA的蛋白模式，以更好地完成其被賦予的重要使命。目前人們已發(fā)現(xiàn)的多個可以結合ssDNA的蛋白質的經(jīng)典結構域包括OB folds，KHdomains, RNA recognition motifs(RRMs), RecA-like domain, whirly domain以及最近剛報道的DrpA domain等等。生命體遺傳物質的高保真復制需要染色體

2、的精確配合與調控，該過程中必不可少的是復制體的正確組裝，引發(fā)體作為復制體在復制起始位點組裝的一個亞復合物，其準確組裝也受到多種機制調控。引發(fā)體由若干蛋白組成，分別是解旋酶，引發(fā)酶以及多個相關的輔助銜接蛋白，它們在DNA復制過程中通過以ssNAD為模板合成復制時它們所必需的RNA引物。準確及時地起始引發(fā)體的正確組裝為正常染色體的復制以及停滯的復制叉重啟奠定了基礎。
　　DnaT是大腸桿菌引發(fā)體蛋白之一，在重啟停滯的復制叉過程中發(fā)揮著

3、重要作用。作為一個銜接蛋白，DnaT聯(lián)系著PriA-PriB-ssDNA三元復合物與DnaB/C復合物，介導了完整的PriA依賴的引發(fā)體的組裝，同時對于完善DNA受到損傷后復制叉重啟機制也有著重大的意義。但針對DnaT如何在此過程發(fā)揮對應的功能，DnaT蛋白與ssDNA以何種方式結合以及DnaT蛋白與PriB之間相互作用的結構生物學研究尚屬于空白。在本研究中，通過X射線晶體學手段，我們解析了蛋白DnaT與單鏈脫氧核糖核酸片段ssDNA復

4、合物的兩種結合狀態(tài)的三個晶體結構，分辨率分別為1.96(A和)2.83(A)以及硒代蛋白晶體2.08(A)。復合物晶體結構展示DnaT蛋白以一種螺旋纖維狀結構盤繞在ssDNA上，DnaT蛋白以一種base-inward的模式結合ssDNA，每個三螺旋束結構域結合兩個堿基脫氧核苷酸。通過與同源DnaT蛋白的序列比對發(fā)現(xiàn)，DnaT84-153主要通過保守的α2 helix識別ssDNA的堿基部分，并通過L3 loop以及α3 helix穩(wěn)定

5、蛋白與磷酸骨架的相互作用。同時，DnaT蛋白采用多個結構域協(xié)同作用的模式來結合底物ssDNA，以更好完成相應的生物學功能。這種蛋白折疊模式以及以三螺旋束花樣結構域結合ssDNA的方式此前均未被報道。因此，該DnaT84-153-dT15 ssDNA復合物晶體結構模型揭示了一種新穎的以三螺旋束花樣結構域結合ssDNA的模式。
　　鑒于復合物結構中只能觀測到降解后的DnaT84-153片段，通過分析不同長度片段的DnaT84-179，

6、DnaT84-153和全長DnaT蛋白對ssDNA結合能力，發(fā)現(xiàn)DnaT蛋白的N端和C端對于提高DnaT結合ssDNA的協(xié)同性發(fā)揮著重要作用。多個結合實驗表明DnaT可以結合多種不同序列的ssDNA，沒有序列識別特異性。
　　底物結合實驗和電鏡負染結果顯示DnaT可以結合到其生理底物phiX-174ssDNA上形成一種棒狀的核蛋白纖維結構，我們推測DnaT在PriA-依賴的引發(fā)體組裝和重新啟動停滯的復制叉過程起到支架的作用，為后續(xù)