NMR方法對(duì)蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)方法是分子結(jié)構(gòu)分析中不可或缺的研究手段，與X射線晶體衍射構(gòu)成生物大分子三維空間結(jié)構(gòu)測(cè)定的兩大互補(bǔ)方法。隨著生命科學(xué)的飛速發(fā)展，在基因組基礎(chǔ)上研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能，尤其是其相互作用網(wǎng)絡(luò)，已成為后基因組時(shí)代生命科學(xué)新的前沿。分子水平蛋白質(zhì)相互作用的研究對(duì)于理解許多生物學(xué)過程至關(guān)重要，在應(yīng)用方面對(duì)于人類疾病分子機(jī)理的理解和藥物設(shè)計(jì)有著重要的指導(dǎo)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，核磁共振方法

2、在研究這類溶液狀態(tài)下原子水平的蛋白質(zhì)和其他分子相互作用及不同強(qiáng)度和不同時(shí)間尺度的動(dòng)力學(xué)方面有著其顯著的優(yōu)勢(shì)。 本論文工作的重點(diǎn)是用異核多維核磁共振方法測(cè)定蛋白質(zhì)-小肽配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)。我們表達(dá)純化了人AF-6蛋白，通過NMR方法測(cè)定了AF-6蛋白PDZ結(jié)構(gòu)域與Bcr蛋白C-末端小肽復(fù)合物的溶液結(jié)構(gòu)，并在此基礎(chǔ)上對(duì)兩者相互作用的方式進(jìn)行了探討。我們還通過主鏈動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)AF-6 PDZ在配體結(jié)合前后ms-μS)艮度上并無明顯變化，

3、根據(jù)相關(guān)時(shí)間推測(cè)AF-6 PDZ具有一定的二聚傾向，但并不影響結(jié)構(gòu)解析。此外，我們還克隆表達(dá)純化了人SUMO-2和SUMO-3全長蛋白，以及SUMO共價(jià)修飾體系中的酶E1(SAE1/2)和E2(Ubc9)，研究了它們之間的相互作用，并嘗試搭建體外共價(jià)修飾系統(tǒng)以獲得共價(jià)修飾的復(fù)合物從而進(jìn)行核磁結(jié)構(gòu)解析。論文分為以下三個(gè)部分： 第一章綜述了各種用于研究蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的核磁共振方法，其中很多技術(shù)也適用于其他系統(tǒng)，如蛋白質(zhì)-核酸、蛋白

4、-糖、蛋白-脂、蛋白-藥物復(fù)合物。這些技術(shù)的選擇取決于以下因素：分子的大小和類型；結(jié)合平衡常數(shù)(緊結(jié)合或弱結(jié)合)；結(jié)合動(dòng)力學(xué)(快交換或慢交換)；化學(xué)計(jì)量和對(duì)稱性。對(duì)于不同的情況，采用不同的策略及實(shí)驗(yàn)方法。此部分首先介紹了研究復(fù)合物前對(duì)樣品條件的優(yōu)化方法；描述了在復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)不能或不太容易確定的情況下對(duì)相互作用界面的界定；接著介紹了復(fù)合物譜峰認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)方法，這與標(biāo)記單個(gè)蛋白質(zhì)的譜峰認(rèn)證完全相同；列舉了X-filter NMR．實(shí)驗(yàn)的不

5、同類型，X-filter實(shí)驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于選擇性區(qū)分分子間或分子內(nèi)的結(jié)構(gòu)信息；最后介紹了如何運(yùn)用這些信息進(jìn)行結(jié)構(gòu)計(jì)算。 第二章是人AF-6蛋白PDZ結(jié)構(gòu)域與Bcr蛋白C-末端小肽復(fù)合物的溶液結(jié)構(gòu)及其動(dòng)力學(xué)研究。首先對(duì)本工作的研究背景，即AF-6蛋白及PDZ結(jié)構(gòu)域的功能和結(jié)構(gòu)、Bcr蛋白的功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了全面的介紹。AF-6基因最早是在急性淋巴性白血病人中作為ALL-1的融合配體被發(fā)現(xiàn)的。隨后的研究表明AF-6是信號(hào)蛋白R(shí)as和Ra

6、pl的效應(yīng)蛋白，在細(xì)胞連接和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。AF-6可以通過其C-末端的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合Bcr，而通過其N-末端的RBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合Ras，從而形成一個(gè)三元復(fù)合物，調(diào)控細(xì)胞一細(xì)胞連接處Ras介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在正常細(xì)胞中，Bcr可以磷酸化AF-6，使得AF-6通過其PDZ結(jié)構(gòu)域與Bcr。中的C-末端部分結(jié)合，此相互作用可以提高AF-6 RBD結(jié)構(gòu)域?qū)as的親和性，通過競(jìng)爭(zhēng)使Ras不再與Raf結(jié)合，從而下調(diào)Raf/MEK/ERK

7、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)失活。通過異核多維核磁共振的方法，我們獲得了AF-6蛋白PDZ結(jié)構(gòu)域與Bcr C-末端小肽(KRQSILFSTEV)復(fù)合物的高分辨率三維溶液結(jié)構(gòu)，并對(duì)每個(gè)殘基在結(jié)合過程中的作用方式進(jìn)行了討論。PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合前后結(jié)構(gòu)變化不大，由六段p折疊和兩段α螺旋組成，Bcr小肽位于PDZ結(jié)構(gòu)域的αB和βB形成的疏水溝槽中，與βB形成反平行的β折疊。一般認(rèn)為PDZ結(jié)構(gòu)域與配基相互作用的特異性是由配體0位和-2位的殘基所

8、決定。與典型的第一類PDZ和第二類PDZ不同的是，AF-6 PDZ結(jié)構(gòu)域αB：1位的殘基是G1n70，與小肽-2位Thr通過范德華力作用，形成了一種非典型的結(jié)合模式。此外我們的結(jié)果表明Bcr C-末端五個(gè)殘基在與AF-6 FDZ結(jié)構(gòu)域的相互作用中都有貢獻(xiàn)，而βB/βC的loop區(qū)不參與結(jié)合。我們對(duì)AF-6 PDZ的分類進(jìn)行了詳細(xì)的討論，發(fā)現(xiàn)不論是基于配體序列還是基于PDZ序列，現(xiàn)有的分類方法都無法適用于AF-6 PDZ，從而需要人們對(duì)P

9、DZ分類及現(xiàn)有機(jī)理進(jìn)行更深入的研究。 通過核磁馳豫研究，我們對(duì)結(jié)合前后的主鏈動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了比較，推測(cè)AF-6 PDZ結(jié)構(gòu)域存在單體一二體平衡，但通過NMR化學(xué)位移實(shí)驗(yàn)證實(shí)二聚對(duì)結(jié)構(gòu)沒有影響。我們的工作不僅對(duì)AF-6 PDz結(jié)構(gòu)域與Bcr小肽結(jié)合的相互作用模式進(jìn)行了深入的研究，也為PDZ分類學(xué)的發(fā)展和藥物設(shè)計(jì)提供了分子基礎(chǔ)。 第三章簡(jiǎn)要介紹了對(duì)泛素類相關(guān)修飾蛋白質(zhì)SUMO及其與酶體系相互作用的研究。SUMO是一類廣泛存在，在

10、所有真核生物中高度保守的蛋白質(zhì)家族。蛋白質(zhì)翻譯后被SUMO修飾這一過程，稱之為SUO化，是一種重要的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的SUMO化是涉及多個(gè)酶的多步調(diào)控的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，需要活化酶E1、綴合酶E2，在多數(shù)情況下還需要連接酶E3，再加上SUMO和底物，通過順序的酶促反應(yīng)，最后SUMO羧基末端的Gly經(jīng)異肽鍵共價(jià)連接到底物蛋白的Lys側(cè)鏈ε-NH<,2>上，這個(gè)Lys通常位于底物蛋白保守的ΨKXE基序上(其中Ψ是疏水殘基，X是任意殘基)

11、。同泛素化主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入蛋白質(zhì)酶體降解不同，SUMO化在細(xì)胞內(nèi)有著多方面重要的生理功能：核內(nèi)外物質(zhì)的運(yùn)輸、蛋白質(zhì)定位、轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控、拮抗泛素化、細(xì)胞周期行進(jìn)、維持基因組的完整性等。目前的研究表明人的SUMO家族各個(gè)成員在細(xì)胞內(nèi)的定位和功能既有交疊又有不同。由于SUMO-1被廣泛研究，而SUMO-2/3報(bào)道不多，我們的工作重點(diǎn)放在對(duì)SUMO-2/3及其酶體系的相互作用研究上。 首先我們成功克隆、表達(dá)、純化了帶有C末端雙Gly活

12、性位點(diǎn)的人SUMO-2/3全長蛋白，為了防止SLIMO-2/3自身的多聚，我們突變了K11位點(diǎn)。然后利用MS、FPLC、CIEF等方法對(duì)蛋白的穩(wěn)定性和均一性做了研究，核磁結(jié)果顯示各個(gè)錢基交叉峰的信號(hào)強(qiáng)度差異很大，表明蛋白有一定的聚合，無法進(jìn)行后續(xù)的譜峰歸屬。此外我們用Ubc9小肽滴定SUMO-2/3，HSQC譜峰的化學(xué)位移沒有任何變化，說明僅僅包含有α1的Ubc9肽段不足以與SUMO-2/3 K11R結(jié)合，空間上其他位點(diǎn)可能也參與了它們