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文檔簡介
1、本研究擬通過制作雄激素受體拈抗劑氟他胺誘導(dǎo)的大鼠干眼模型,觀察大鼠淚液分泌量、淚膜穩(wěn)定性、眼表組織病理學(xué)變化;通過免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)在角膜、結(jié)膜、淚腺和瞼板腺上皮的表達(dá),探討雄激素受體拮抗劑氟他胺導(dǎo)致干眼的發(fā)病機制,分析該模型的科學(xué)性及實用性,并為干眼的治療提供理論依據(jù)。
第一部分 氟他
2、胺誘導(dǎo)大鼠干眼模型的建立
目的:
建立雄激素受體拮抗劑氟他胺誘導(dǎo)的大鼠干眼動物模型,為進(jìn)一步探討雄激素在干眼發(fā)病機制中的作用提供基礎(chǔ)。
方法:
清潔級健康成年SD雌性大鼠32只,采用隨機數(shù)字表法分為高濃度組、中濃度組、低濃度組和對照組,每組各8只。高、中、低濃度組分別用濃度為16mg·kg-1·d-1、13mg·kg-1·d-1、10 mg·kg。1·d-1氟他胺溶液灌胃,對照組1ml·d-1生理
3、鹽水灌胃,每組分別于給藥前和給藥后2、4、8、16、20周測干眼臨床指標(biāo):淚液分泌試驗(SchirmerⅠ test,SⅠt)、淚膜破裂時間(tear firm break-up time,BUT)及角膜熒光素鈉染色評分。造模成功標(biāo)準(zhǔn):給藥后20周時高、中、低濃度組大鼠的干眼臨床指標(biāo)與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。每組分別于給藥前、給藥后10、20周行心臟穿刺取血,采用放射免疫法測量血清睪酮及雌二醇濃度。使用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件數(shù)
4、據(jù)分析,描述性統(tǒng)計值用(X)+S表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:
1.SchirmerⅠ test:給藥后4周時高濃度組(8.20±0.58mm)、中濃度組(8.53±0.34mm)SⅠ t值開始減少,與對照組(9.84±0.54mm)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);8周時高濃度組(7.13±0.25mm)、中濃度組(7.04±0.47mm)、低濃度組(8.43±0.67mm)的SⅠt值均少于對照
5、組(9.94±0.43mm)(P<0.05);隨著時間延長,20周時高濃度組(3.23±0.31 mm)、中濃度組(3.98±0.36mm)、低濃度組(4.73±0.18mm)的SⅠt值進(jìn)一步減少,兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且均較對照組(9.60±0.60mm)下降大于50%(P<0.05)。
2.BUT:給藥后4周時高濃度組(6.80±1.05s)大鼠即出現(xiàn)BUT縮短,分別與低濃度組(8.63±0.65s)
6、、對照組(9.25±1.03s)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);8周時,高濃度組(5.20±0.58s)、中濃度組(7.21±0.56s)、低濃度組(8.32±0.37s)的BUT兩兩比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且均短于對照組(10.70±1.07s)(P<0.05);20周時高(2.40±0.61s)、中(4.32±0.68s)、低(6.10±0.81s)濃度組的BUT較對照組(9.12±0.73s)進(jìn)一步縮短,各
7、組之間兩兩比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
3.角膜熒光素鈉染色:給藥后4周時高、中濃度組開始出現(xiàn)角膜上皮點狀熒光素鈉著色;8周時角膜熒光素鈉染色評分高濃度組(6.80±0.79)、中濃度組(4.13±0.53)分別與低濃度組(2.50±1.08)、對照組(0.56±1.30)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);16周時高濃度組可見彌漫性大片狀著色,中、低濃度組角膜上皮出現(xiàn)小片狀著色,隨時間延長高、中、低濃度組角
8、膜熒光素鈉染色評分逐漸加重,20周時高濃度組(9.05±0.49)、中濃度組(7.21±0.57)、低濃度組(4.82±0.47)、對照組(1.05±1.13)染色評分兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
4.性激素水平:給藥后10周時高濃度組(4.38±0.68pg·ml-1)、中濃度組(3.56±0.53pg·ml-1)的血清睪酮濃度開始升高,分別與對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);20周時高濃度組(
9、5.08±0.21pg·ml-1)、中濃度組(4.23±0.16pg·ml-1)、低濃度組(3.58±0.24pg·ml-1)血清睪酮濃度較對照組(2.24±0.15pg·ml-l)不同程度升高,兩兩比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給藥后10、20周時高、中、低濃度組血清雌二醇濃度較對照組均無明顯差異(P>0.05),各組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論:
雄激素受體拮抗劑氟他胺溶液灌胃可以
10、成功建立混合型干眼模型,且干眼的嚴(yán)重程度呈時間和藥物濃度依賴性。
第二部分 氟他胺誘導(dǎo)大鼠干眼模型的機制研究
目的:
探討氟他胺誘導(dǎo)大鼠干眼模型的作用機制。
方法:
實驗動物及分組同第一部分。20周后麻醉下處死各組動物,取角膜、結(jié)膜、淚腺和瞼板腺組織HE染色觀察各上皮病理組織變化,并采用免疫組織化學(xué)方法檢測TNF-α、IL-1α在各組織上皮的表達(dá)。每張切片選取5個200倍視野進(jìn)行拍照,并
11、用Image-Pro Plus分析軟件對照片進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù),使用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件數(shù)據(jù)分析,描述性統(tǒng)計值用X±S表示,TNF-α、IL-1α的表達(dá)量用單因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:
1.角膜組織病理學(xué)觀察:高、中、低濃度組角膜出現(xiàn)不同程度鱗狀上皮層次明顯增加,排列紊亂且可見表層細(xì)胞不規(guī)則缺失,翼狀細(xì)胞及基底細(xì)胞排列紊亂,基質(zhì)層水腫,高濃度組病變最顯著。
12、對照組角膜上皮細(xì)胞層次正常較扁平,表層細(xì)胞不角化,翼狀上皮細(xì)胞呈多角形,基底細(xì)胞排列整齊。
2.淚腺組織病理學(xué)觀察:高、中、低濃度組出現(xiàn)不同程度淚腺上皮細(xì)胞扁平萎縮小而密集、胞漿淡染,可見空泡,細(xì)胞排列紊亂,腺腔擴大。腺泡萎縮融合,大小不一,結(jié)構(gòu)排列紊亂,高濃度組改變最為顯著。對照組可見結(jié)締組織深入實質(zhì)將腺組織分割成小葉,邊界清晰而規(guī)則的腺泡細(xì)胞大小均勻,內(nèi)層是柱狀上皮細(xì)胞,核位于基底部。
3.結(jié)膜組織病理學(xué)觀察:高
13、、中、低濃度組出現(xiàn)不同程度結(jié)膜上皮細(xì)胞層數(shù)增多,層次間模糊,排列紊亂呈角化狀,基底層細(xì)胞排列不整齊,可見炎性細(xì)胞浸潤。對照組結(jié)膜上皮細(xì)胞排列規(guī)則,無角化及炎性細(xì)胞浸潤。
4.瞼板腺組織病理學(xué)觀察:高、中、低濃度組出現(xiàn)不同程度瞼板腺腺體萎縮融合,鱗狀上皮化生,腺管壁增厚,基底細(xì)胞變薄,腺管周圍纖維化和腺管開口擴張。對照組瞼板腺可見邊界清晰而規(guī)則的腺細(xì)胞,大小均勻排列整齊,腺管呈一同心圓狀,管壁厚度正常。
6.角膜中TN
14、F-α、IL-1α的表達(dá):免疫組化結(jié)果顯示高、中、低濃度組TNF-α、IL-1α大量表達(dá)于角膜上皮細(xì)胞胞漿及少量表達(dá)于基質(zhì)層,對照組微量表達(dá)。高、中、低濃度組每1000個角膜上皮細(xì)胞中TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)。高、中濃度組角膜上皮TNF-α、IL-1α的陽性細(xì)胞數(shù)相對低濃度組較高(P<0.05)。
7.淚腺中TNF-α、IL-1α的表達(dá):免疫組化結(jié)果顯示高、中濃度組TNF-α、IL-
15、1α大量表達(dá)于淚腺腺泡上皮細(xì)胞胞漿,低濃度組可見中量表達(dá),對照組少量表達(dá)。高、中、低濃度組每1000個淚腺細(xì)胞中TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)。高、中濃度組淚腺上皮TNF-α的陽性細(xì)胞數(shù)相對低濃度組較高(P<0.05),但高、中濃度組間比較,差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。高、中、低濃度組的IL-1α陽性細(xì)胞計數(shù)組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
8.瞼板腺中TNF-α、
16、IL-1α的表達(dá):免疫組化結(jié)果顯示高、中、低濃度組TNF-α、IL-1α大量表達(dá)于瞼板腺腺泡細(xì)胞胞漿,對照組少量表達(dá)。高、中、低濃度組每1000個瞼板腺腺泡細(xì)胞中TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)。高、中濃度組TNF-α、IL-1α的陽性細(xì)胞計數(shù)相對低濃度組較高(P<0.05),但高、中濃度組間比較,差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。
9.結(jié)膜中TNF-α、IL-1α的表達(dá):免疫組化結(jié)果顯
17、示高、中、低濃度組TNF-α、IL-1α大量表達(dá)于結(jié)膜上皮細(xì)胞胞漿,微量表達(dá)于固有層,對照組少量表達(dá)于結(jié)膜上皮細(xì)胞胞漿。高、中、低濃度組每1000個結(jié)膜上皮細(xì)胞中TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)。高、中、低濃度組TNF-α的陽性細(xì)胞計數(shù)組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。高濃度組IL-1α的陽性細(xì)胞計數(shù)相對低濃度組較高(P<0.05),但高、中濃度組以及中、低濃度組間比較,差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)
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