抗雄激素物質(zhì)氟他胺作用于受孕SD大鼠引起尿道下裂的機(jī)制研究.pdf

1、尿道下裂是小兒泌尿外科常見畸形之一，主要見于男性。據(jù)國外統(tǒng)計，活產(chǎn)嬰兒中發(fā)病率近1／250-1／300，我國發(fā)病率約為2-3／1000。近三十年來，此病發(fā)病率有明顯增加的趨勢，幾乎增加了一倍，這顯然是用遺傳因素所不能解釋的，當(dāng)然不能排除監(jiān)測或報告系統(tǒng)逐漸完善外，但病例的增加之迅速應(yīng)當(dāng)另有原因。 目前，很多泌尿生殖的領(lǐng)域的學(xué)者已把注意力放在外界環(huán)境中，一些學(xué)者認(rèn)為環(huán)境中廣泛存在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾污染物可能是造成尿道下裂發(fā)病率上升的

2、原因。但環(huán)境污染物作用于人，引發(fā)尿道下裂的發(fā)病的生物效應(yīng)機(jī)制并不十分清楚，有研究者推測，環(huán)境污染物可能是通過迫使機(jī)體正常內(nèi)分泌因素改變而發(fā)生下裂畸形，因為人們經(jīng)常攝入或接觸有抗雄激素的活性的外源性物質(zhì)如殺蟲劑、塑料制品的副產(chǎn)品、藥物等等，導(dǎo)致其出生的后代出現(xiàn)尿道下裂發(fā)生。從某種程度上看，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物更可能解釋全球范圍內(nèi)尿道下裂發(fā)生和發(fā)病率升高的某些原因。 已有的研究表明，環(huán)境中具有抗雄激素活性的物質(zhì)能與雄激素受體(andro

3、gen receptor；AR)相互作用，與雄激素競爭AR，主要是AR拮抗劑，被稱為環(huán)境抗雄激素。眾所周知，雄激素在雄性顯型表達(dá)中起著關(guān)鍵的作用，以及AR在性分化和發(fā)育過程介導(dǎo)雄激素作用的重要性，環(huán)境抗雄激素暴露更有可能對雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生不良影響，因此環(huán)境抗雄激素的研究受到了廣泛的關(guān)注。自上世紀(jì)九十年代以來，有關(guān)環(huán)境抗雄激素物質(zhì)干擾健康效應(yīng)的報導(dǎo)逐漸增多，研究資料顯示，抗雄激素物質(zhì)能夠引起魚類及多種野生生物的生殖功能下降，動物實驗研

4、究結(jié)果表明，抗雄激素物質(zhì)能改變體內(nèi)的性激素平衡，損傷雄性動物的生殖功能，但有關(guān)抗雄激素物質(zhì)對生殖發(fā)育毒性的研究報導(dǎo)相對較少，且結(jié)論缺乏一致性；同時對其生殖系統(tǒng)早期發(fā)育的干擾及分子機(jī)理的研究也缺乏系統(tǒng)性。因此，我們選擇了抗雄激素物質(zhì)氟他胺(flutamide,Flu)作為研究對象，建立尿道下裂動物模型，以及觀察出生后雄性子代的性分化和性發(fā)育情況，并采用組織病理學(xué)技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、實時熒光定量的RT-PCR

5、技術(shù)及基因芯片技術(shù)，探討Flu作用于受孕SD大鼠引起尿道下裂的分子機(jī)理，為臨床尿道下裂的防治提供理論和試驗依據(jù)。 第一部分 氟他胺建立SD大鼠尿道下裂動物模型的實驗研究 從孕12-17d連續(xù)6d每天8：00腹部皮下分別注射用生理鹽水配制的Flu O、4492.2、4882.8、5273.4、5664.0、6054.6 μ g/kg。于孕18d每組解剖兩只孕鼠，提取子代雄性胎鼠尿生殖結(jié)節(jié)做病理切片，同時觀察睪丸位置和前列

6、腺發(fā)育情況。并于出生后第2、13、28d觀察雄性仔鼠性分化與性發(fā)育的指標(biāo)。實驗結(jié)果：Flu染毒組雄性子一代肛殖距各組均明顯小于對照組，尿道下裂的發(fā)生率依次為0、29.00％、63.68％、93.02％、100％；單側(cè)隱睪發(fā)生率分別為0、4.55％、8.70％、13.95％、15.56％；乳暈延遲退化率均為100％；各組前列腺不發(fā)育或發(fā)育不全。不同時間段各用藥組與AGD做直線相關(guān)分析，其相關(guān)系數(shù)r分別為-0.6933，-0.7172，-0

7、.7480，經(jīng)t檢驗P值均小于0.01。結(jié)果說明，在一定的劑量范圍內(nèi)，隨著染毒劑量的增加，大鼠的性分化和性發(fā)育異常亦隨之有增加的趨勢，尤其是肛殖距與染毒劑量之間呈現(xiàn)高度的負(fù)相關(guān)。且針對畸形指標(biāo)尿道下裂而言，F(xiàn)lu最大無作用劑量為4492.2 μ g／kg。 第二部分 氟他胺引起SD大鼠尿道下裂機(jī)制的實驗研究 對F0親代母鼠從孕12-17d皮下注射Flu(6054.6 μ g／kg)染毒，于雄性子代出生后第2d檢測睪酮激

8、素水平；在胚胎20d解剖孕鼠，提取雄性胎鼠尿生殖結(jié)節(jié)做病理切片和免疫組織化學(xué)制片；同時提取雄性胎鼠睪丸做電鏡觀察、免疫組織化學(xué)及實時熒光定量的RT-PCR實驗。實驗結(jié)果：Flu染毒組雄性子代出生后第2d睪酮激素水平降低。胚胎期病理切片顯示尿道下裂的形成。電鏡觀察睪丸間質(zhì)細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹。免疫組織化學(xué)結(jié)果提示：在生殖結(jié)節(jié)、間充質(zhì)細(xì)胞、尿道細(xì)胞中EGF、EGFR、PCNA蛋白表達(dá)不足，Caspase-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，AR蛋白表

9、達(dá)與對照組相同。在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中P450scc、3B-HSD、PCNA蛋白表達(dá)降低，AR蛋白表達(dá)與對照組相同。實時熒光定量的RT-PCR實驗顯示：在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中P450scc、3B-HSD、P450c17基因表達(dá)降低，17B-HSD、PCNA基因表達(dá)減弱，AR基因表達(dá)與對照組相同。實驗結(jié)果提示Flu引起尿道下裂的發(fā)生，并不是通過改變受體水平而實現(xiàn)的，其可能的機(jī)制為：1、Flu通過抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞中合成睪酮代謝酶的活性，降低睪酮激素水平

10、，導(dǎo)致尿道下裂的發(fā)生；2、Flu通過與雄激素競爭結(jié)合AR，阻止AR-DNA結(jié)合和雄激素依賴基因轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致尿道下裂的發(fā)生。 第三部分 氟他胺對胚胎期SD大鼠睪丸發(fā)育整體基因表達(dá)水平影響的研究 對FO親代母鼠從孕12-17d皮下注射Flu(6250.0ug／kg)染毒，于胚胎20d解剖孕鼠，取出實驗組與對照組雄性胎鼠睪丸，提取mRNA，分別用cy5(實驗組)和cy3(對照組)探針逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記，與Rat12KcDNA(12000

11、位點基因芯片)表達(dá)譜芯片雜交，熒光掃描分析，篩選Cy5／Cy3比值大于2.0或小于0.5的差異表達(dá)基因。結(jié)果：①類固醇激素代謝調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成關(guān)鍵酶——細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶(cholesterol side-chaincleavage enzyme，P450scc)和17β-羥基脫氫酶(hydroxysteroid(17-beta)dehydro~enase 10，Hsdl7b10)下調(diào)，降低睪酮激素的代謝水

12、平。②參與合成代謝相關(guān)基因表達(dá)，核糖體蛋白S9(Ribosomal protein S9,Rps9)下調(diào)，使睪丸組織細(xì)胞蛋白質(zhì)合成不足。③對細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因表達(dá)，YYl(YYltranscriotion factor)、Rac2(RAS-related C3 botulinum substrate 2)基因下調(diào)，說明此期睪丸組織凋亡增強(qiáng)。④對免疫調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，EB病毒誘導(dǎo)基因3(Epstein-Barr virus induced

13、 gene 3，Ebi3)、溶菌酶基因(1ysozyme gene)與溶菌酶外顯子1-4亞型基因(1ysozyme gene eXOllS 1-4)下調(diào)，使睪丸細(xì)胞降低了對病原菌的抵抗力和免疫能力。⑤對氧化代謝相關(guān)的基因表達(dá)，已糖激酶3(Hexokinase 3，Hk3)上調(diào)和完整線粒體基因組(completemitochondrial genome)上調(diào)，提示可能是由于有氧代謝的ATP供能不足，促使糖孝解增強(qiáng)以滿足合成代謝供能。⑥對信

14、號傳遞及信號通道相關(guān)基因表達(dá)，similar tO calsyntenin 1基因和Laspl(LIM and SH3 protein 1)基因下調(diào)，前者可以調(diào)節(jié)Ca<'2+>介導(dǎo)多種信號傳遞途徑；后者可以通過Ras蛋白的信號傳遞途徑調(diào)節(jié)酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號系統(tǒng)活性。 從以上的結(jié)果可見，F(xiàn)lu能夠引起睪丸性激素合成下降，并能使睪丸合成代謝、氧化代謝、免疫調(diào)節(jié)及信號通道的相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)或上調(diào)，且凋亡增強(qiáng)，這些說明了Flu對睪丸的