CpG-Au@HBc病毒樣顆粒的構(gòu)建及其跨膜機制和免疫刺激能力的研究.pdf

1、乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒(Hepatitis virus B virus core protein virus likeparticles，HBc VLPs)因其不具有乙肝病毒的復制能力而又具備較強的免疫原性而被廣泛應用于構(gòu)建新型疫苗。另一方面，HBc VLPs的正二十面體空腔結(jié)構(gòu)和解聚/自組裝特性使得其還能夠作為納米載體呈遞基因、納米粒子等。本課題利用HBc VLPsC末端的富集正電荷序列可以通過靜電吸引力與核酸相互作用的特點，構(gòu)建

2、了一種同時包裹有CpG寡核苷酸鏈(CpG ODNs)佐劑和金納米粒子的HBc VLPs，對其跨細胞膜機制和免疫刺激能力進行了初步研究，具體工作如下:
　　1.構(gòu)建CpG-Au@HBc VLPs納米復合物:1）在原核表達系統(tǒng)（E.coli）內(nèi)誘導HBc VLPs蛋白的表達，采用鹽析和色譜柱分離的方法純化出較純的HBcVLPs蛋白;2）以“種子生長法”和改良的Frens法合成出不同粒徑、尺寸較均一的納米金球(Au NSs)，通過加鹽老

3、化的方法在Au NSs表面接上巰基化的CpGODNs;探究了不同粒徑大小(5-15 nm)的Au NSs與巰基化CpG ODNs的連接效率，研究發(fā)現(xiàn)粒徑越小的Au NSs體系在與CpG ODNs連接過程中越穩(wěn)定，15nm Au NSs體系則較易聚沉;3）HBc VLPs蛋白解聚后能夠與CpG-Au NPs因靜電相互作用結(jié)合并實現(xiàn)包封，形成殼核結(jié)構(gòu)的CpG-Au@HBc VLPs納米復合物。
　　2.通過MTT實驗對CpG-Au@H

4、Bc VLPs納米復合物的細胞生物相容性進行了評價;利用流式細胞術(shù)證實了CpG-Au@HBc VLPs能夠有效進入RAW264.7細胞，同時結(jié)合幾種不同的胞吞途徑特異抑制劑確定了其跨膜進入細胞的機制;此外，利用相差顯微鏡觀察了CpG-Au@HBc VLPs對細胞形態(tài)的影響。
　　3.建立小鼠免疫實驗模型，研究CpG-Au@HBc VLPs納米復合物的免疫刺激能力，結(jié)果顯示:1）細胞免疫應答能力強:小鼠脾細胞中CD4+、CD8+T細

5、胞表達量及Th1型細胞因子IFN-γ分泌量明顯高于其它組（HBc VLPs組、CpG@HBc VLPs組及弗氏佐劑與HBc VLPs聯(lián)用組）;2）能引發(fā)中等程度的體液免疫應答:小鼠血清中抗HBc抗體滴度及Th2型細胞因子IL-4分泌量高于HBcVLPs組和CpG@HBc VLPs組，達到傳統(tǒng)弗氏佐劑（強體液免疫誘導佐劑）與HBc VLPs聯(lián)用組的一半以上;3）Au NPs在促進整個復合物的體液和細胞免疫刺激效果中都發(fā)揮了作用（與CpG@