耐RNase病毒樣顆粒的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、第一部分內(nèi)含中東呼吸綜合征冠狀病毒和埃博拉病毒基因片段病毒樣顆粒的構(gòu)建及表達(dá)
　　2012年9月世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道,在中東地區(qū)的一位患有急性呼吸道疾病的病人中發(fā)現(xiàn)了一種新的SARS樣冠狀病毒，患者表現(xiàn)為急性呼吸道感染和腎功能衰竭等臨床癥狀。后來(lái)該新型人冠狀病毒病原體被命名為中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）。1976年在非洲國(guó)家發(fā)現(xiàn)了埃博拉病毒，它是引起埃博拉出血熱的烈性傳染病的病原，是一種目前人類(lèi)已知的恐怖、致命

2、的病毒之一。2013年埃博拉出血熱重新在西非幾個(gè)國(guó)家爆發(fā)，雖然我國(guó)目前沒(méi)有相關(guān)疫情的爆發(fā)，但是不能排除輸入性病例的可能。雖然有實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了多種檢測(cè)這兩種病毒核酸的方法，但尚無(wú)質(zhì)控品或安全可靠的陽(yáng)性參考品。因此，需要一種RNA質(zhì)控品全程監(jiān)控及保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
　　目的:
　　構(gòu)建內(nèi)含中東呼吸綜合征冠狀病毒部分基因和埃博拉病毒部分GP和NP基因病毒病毒樣顆粒，作為核酸檢測(cè)的質(zhì)控品。該質(zhì)控品具有穩(wěn)定好、耐 RNase、無(wú)

3、潛在生物傳染性的危害的優(yōu)勢(shì)，可用于全程監(jiān)控RNA病毒核酸檢測(cè)，對(duì)于中東呼吸綜合征冠狀病毒和埃博出血熱病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷具有重要意義及實(shí)用價(jià)值。
　　方法:
　　將 MS2噬菌體包膜蛋白和成熟酶蛋白基因編碼序列插入到表達(dá)載體pET32a，構(gòu)建成 p32MS中間載體，再 MERS-CoV N基因和埃博拉病毒部分GP和 NP基因病毒基因片段連接到成熟酶蛋白基因的下游，獲得的重組載體p32MS-X(MERS或Ebola)轉(zhuǎn)化到E.co

4、li BL21(DE)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后進(jìn)行耐酶實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果獲得含 MERS-CoV N基因片段的顆粒和埃博拉GP和NP基因片段顆粒，可抵抗RNase降解，在4℃保存至少120天。
　　結(jié)果:
　　成功構(gòu)建了含 MERS-CoV N基因和埃博拉病毒 GP和 NP基因 VLPs，可抵抗RNase降解，在4℃保存120天。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建了含MERS-CoV N基因和

5、埃博拉病毒GP和NP基因的VLPs，其安全、穩(wěn)定良好，可作為檢測(cè)MERS-CoV和Ebola virus核酸的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品。
　　第二部分VLPs在多重RT-PCR檢測(cè)呼吸道病毒中的應(yīng)用
　　呼吸道病毒是最主要引起人類(lèi)呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率的原因之一，特別是嬰幼兒和老人。近年來(lái)市場(chǎng)上有多種多重檢測(cè)呼吸道病毒的商業(yè)試劑盒，但費(fèi)用很高，且使用過(guò)程中需要專(zhuān)用設(shè)備，很難推廣使用。
　　目的:
　　我們已經(jīng)建立了基

6、于QIAxcel自動(dòng)化毛細(xì)管電泳儀的兩管同時(shí)檢測(cè)16種呼吸道病毒的方法（9+7方法），本研究擬通過(guò)進(jìn)一步的改進(jìn)使之成為一種靈敏度高、特異性更好、內(nèi)參穩(wěn)定，更高效迅速的方法，進(jìn)一步提高全國(guó)疾控系統(tǒng)常規(guī)監(jiān)測(cè)呼吸道病毒的能力。
　　方法:
　　改進(jìn)已經(jīng)建立兩管同時(shí)檢測(cè)16種呼吸道病毒的方法為一管檢測(cè)13種呼吸道病毒及亞型（13重法），能檢測(cè)到的呼吸道病毒包括：甲型流感病毒(FluA)，乙型流感病毒(FluB)，09年季節(jié)性流感病毒

7、 H1N1亞型(09H1N1)，季節(jié)性流感病毒H3N2亞型 H3N2(sH3N2)，副流感病毒1-4型(PIV1-4)，鼻病毒(HRV)，腺病毒(Adv)，呼吸道合胞病毒 A型(RSVA)，呼吸道合胞病毒 B型(RSVB)和人偏肺病毒(HMPV)。在提取樣本核酸前中加入噬菌體MS2 VLPs作為內(nèi)參，針對(duì)13種病毒及亞型設(shè)計(jì)14對(duì)嵌合引物、一個(gè)通用引物(Tag)、一對(duì)內(nèi)參引物(MS2 F, MS2 R)，所有引物均加入一個(gè)反應(yīng)體系，并優(yōu)

8、化擴(kuò)增條件。用兩管檢測(cè)16種呼吸道病毒的方法作為參考標(biāo)準(zhǔn)，并使用310份臨床標(biāo)本對(duì)這兩種方法進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較，對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致再重復(fù)試驗(yàn)和測(cè)序驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　建立了一種基于 Qiaxcel系統(tǒng)的單管多重 RT-PCR檢測(cè)13種呼吸道病毒及亞型的方法。通過(guò)檢測(cè)310份臨床標(biāo)本，與已建立的兩管同時(shí)檢測(cè)16種呼吸道病毒的方法比較，陽(yáng)性率分別為72.90％和69.03%。兩種方法檢測(cè)病毒的一致高達(dá)97.10%，單管多重

9、 RT-PCR檢測(cè)腺病毒、鼻病毒、人偏肺病毒和副流感病毒1型和3型的靈敏度明顯高于兩管法，表明單管多重 RT-PCR檢測(cè)呼吸道病毒的體系靈敏度和特異更好。
　　結(jié)論:
　　1.噬菌體 MS2 VLPs作為穩(wěn)定內(nèi)參保證了單管多重 RT-PCR檢測(cè)呼吸道病毒結(jié)果的有效性。
　　2.單管多重 RT-PCR檢測(cè)呼吸道病毒的方法有更穩(wěn)定的內(nèi)部質(zhì)控，特異性和靈敏度更好，更快速和方便檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)具有在全國(guó)疾控系統(tǒng)應(yīng)用于呼吸道病毒感染中