河北地區(qū)漢族人群人類血小板同種抗原等位基因頻率研究.pdf

1、目的:人類血小板特異性同種異體抗原(human platelet-specificalloantigen，HPA)是由血小板糖蛋白攜帶的，主要位于人血小板細(xì)胞膜的一大類抗原，其基因具有單一核苷酸多態(tài)性(single nueleofide polymo-rphism，SNP)。血小板制品在臨床上的應(yīng)用日益廣泛，在臨床輸注過(guò)程中，由于血小板特異性抗原不相合而發(fā)生血小板同種免疫反應(yīng)，產(chǎn)生血小板同種抗體，導(dǎo)致同種免疫性血小板減少，誘發(fā)如輸血后血

2、小板減少性紫癜(PTP)、血小板輸注無(wú)效(PTR)及新生兒同種免疫血小板減少性紫癜(NAITP)等疾病，同時(shí)在臨床移植中還會(huì)引起移植排斥等相關(guān)疾病。在新生兒同種免疫血小板減少性紫癜(NAITP)和輸血后血小板減少性紫癜(PTP)疾病中，HPA抗體是主要致病原因。對(duì)一些隨機(jī)輸注血小板而產(chǎn)生血小板輸注無(wú)效的患者，輸注HLA抗原相容的血小板也未能使病情好轉(zhuǎn);在一些血小板輸注無(wú)效患者體內(nèi)，沒(méi)有檢測(cè)到淋巴細(xì)胞毒抗體，這兩點(diǎn)都提示抗血小板特異性抗體

3、存在于這些患者體內(nèi)，因此準(zhǔn)確鑒定和檢測(cè)HPA，不管是對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)還是輸血實(shí)踐都具有非常重要的意義。[1-6]
　　大量群體遺傳學(xué)研究表明，HPA基因的分布具有明顯的種族和地域的差異。隨著成分血在臨床上的應(yīng)用，HPA基因頻率的調(diào)查對(duì)于臨床輸血實(shí)踐具有重要的意義，有助于解決血小板輸注無(wú)效的難題，同時(shí)可以根據(jù)基因頻率分布預(yù)測(cè)不同地區(qū)，不同種族間血小板特異性同種免疫的發(fā)生概率。目前，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的關(guān)于中國(guó)人群HPA系統(tǒng)的基因多態(tài)性研究報(bào)道甚少

4、，并且沒(méi)有關(guān)于河北漢族人群的較大樣本量精確的基因分型數(shù)據(jù)資料。
　　本研究的目的在于應(yīng)用PCR-SSP的方法，研究河北地區(qū)漢族人群血小板捐獻(xiàn)者基因的多態(tài)性和分布特征，探討河北地區(qū)漢族人群HPA基因頻率，建立本地化的血小板捐獻(xiàn)者資料庫(kù)，為患者提供相配合的血小板，避免產(chǎn)生同種抗體，預(yù)防血小板輸注無(wú)效的發(fā)生。
　　方法:
　　1、制備基因組DNA:標(biāo)本來(lái)自隨機(jī)抽取的河北籍漢族健康無(wú)血緣關(guān)系的血小板捐獻(xiàn)者930名，用EDTA抗

5、凝管采取靜脈血5ml，采用TIANGEN血液基因組DNA純化試劑盒提取DNA。提取得到的DNA進(jìn)行純度和濃度測(cè)定，應(yīng)滿足OD260/OD280比值為1.7-1.9，濃度30ng/μl左右。
　　2、等位基因分型:采用天津秀鵬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司人類血小板同種抗原1-17基因檢測(cè)試劑盒，依據(jù)NCBI Gene Bank目前擁有的HPA等位基因序列，運(yùn)用PCR-SSP方法對(duì)HPA1-17等位基因系統(tǒng)進(jìn)行分型。
　　3、PCR產(chǎn)物

6、凝膠電泳分析:將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至瓊脂糖凝膠電泳，在紫外/凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍攝成像，根據(jù)提供的引物孔位圖解釋分型結(jié)果。
　　4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:基因頻率采用基因直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)算，并進(jìn)行Hardy-Weinberg(HW)檢驗(yàn)驗(yàn)證吻合度。HPA各系統(tǒng)對(duì)偶抗原不配合率采用公式P=2ab（1-ab）計(jì)算。（a，b分別代表a和b基因頻率）
　　河北地區(qū)930名漢族人群HPA基因頻率與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)漢族人群以及國(guó)外其他地區(qū)人群基

7、因頻率的比較采用x2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P設(shè)為0.05。
　　結(jié)果:
　　1、930名河北地區(qū)漢族血小板捐獻(xiàn)者的HPA基因型檢測(cè)結(jié)果如下
　　HPA-1aa919人，HPA-1ab11人，HPA-1bb0人;HPA-2aa861人，HPA-2ab69人，HPA-2bb0人;HPA-3aa339人，HPA-3ab421人，HPA-3bb170人;HPA-4aa928人，HPA-4ab2人，HPA-4bb0人;HPA-5aa91

8、1人，HPA-5ab19人，HPA-5bb0人;HPA-6aa919人，HPA-6ab10人，HPA-6bb0人;HPA-15aa294人，HPA-15ab358人，HPA-15bb278人;在HPA-7，8，9，10，11，12，13，14，16，17位點(diǎn)上，930名血小板捐獻(xiàn)者的基因型均為aa純合子，未檢測(cè)到b基因。
　　2、930名河北地區(qū)漢族血小板捐獻(xiàn)者的HPA基因頻率如下
　　HPA-1a基因頻率為99.41％，H

9、PA-1b基因頻率為0.59％; HPA-2a基因頻率為96.29％，HPA-2b基因頻率為3.71％; HPA-3a基因頻率為59.09％，HPA-3b基因頻率為40.91％; HPA-4a基因頻率為99.89％，HPA-4b基因頻率為0.11％; HPA-5a基因頻率為98.98％，HPA-5b基因頻率為1.02％;HPA-6a基因頻率為99.46％，HPA-6b基因頻率為0.54％; HPA-15a基因頻率為50.86％，HPA-

10、15b基因頻率為49.14％; HPA-7a，8a，9a，10a，11a，12a，13a，14a，16a，17a基因頻率為100％，其相應(yīng)b基因頻率為0。
　　結(jié)論:
　　1、經(jīng)過(guò)大量樣本的實(shí)驗(yàn)操作，證明PCR-SSP的方法為進(jìn)行HPA抗原檢測(cè)的首選方法。
　　2、HPA等位基因在人群中的分布具有種族和地域的差異，該基因在河北漢族人群中具有非常豐富的多態(tài)性，河北地區(qū)漢族人群HPA-3，15的不配合率較高，均超過(guò)37％，

11、在血小板輸注中產(chǎn)生抗體的機(jī)會(huì)也較高，推測(cè)HPA-3，15是河北地區(qū)漢族引起血小板輸血反應(yīng)的主要原因，在血小板輸注中需給予關(guān)注。
　　3、河北地區(qū)漢族人群HPA基因頻率在與國(guó)內(nèi)外其他地區(qū)HPA-1-6，15基因多態(tài)性分布的比較分析中發(fā)現(xiàn)，HPA-1，3，15與國(guó)內(nèi)大部分區(qū)域沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但HPA-1與歐洲，美國(guó)黑人有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HPA-2，5與國(guó)內(nèi)大部分區(qū)域及國(guó)外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明河北地區(qū)HPA基因分布有其獨(dú)自的特點(diǎn)。