基于網(wǎng)絡比較的方劑銀翹散抗流感作用機制研究.pdf

1、中藥中含有多種化學成分，作用機制非常復雜，可以通過靶向多個靶點和通路發(fā)揮治療效果。目前缺少一種系統(tǒng)的實驗方法對中藥的作用機制進行研究，而網(wǎng)絡藥理學致力于尋找調(diào)節(jié)多個靶點和通路的藥物，或者將藥物進行組合治療疾病，減少病人用藥量以降低毒副作用，它的發(fā)展為中藥治療疾病的機制研究提供了新的方法。目前，國內(nèi)外學者利用網(wǎng)絡藥理學方法對多個中藥經(jīng)典方劑進行了闡釋，如Xiang Li等建立了化合物-靶點-通路網(wǎng)絡，研究了中藥方劑芪參益氣湯潛在的活性化合

2、物的作用靶點和通路；Linli Wang等通過網(wǎng)絡藥理學對血塞通注射劑多靶點、多通路的復雜作用機制進行了研究[1,2]。銀翹散是中醫(yī)經(jīng)典方劑之一，在治療常見的感冒、發(fā)燒、咳嗽及其他氣管性疾病方面有著悠久的歷史。關于銀翹散的實驗研究和臨床應用報道已有很多，但是系統(tǒng)研究銀翹散作用機制的報道很少。本論文采集感染流感病毒小鼠肺組織中的基因表達數(shù)據(jù)，構建流感病毒感染小鼠的“癥候網(wǎng)絡”，研究銀翹散對癥候網(wǎng)絡的影響，以期全面揭示銀翹散抗流感作用機制。

3、
　　1、構建感染甲型流感病毒的小鼠模型，分別在造模成功后第1、3、5天取正常組、模型組、達菲陽性對照組和銀翹散治療組小鼠的肺組織，提取肺組織中的總 RNA。通過高通量測序的手段獲得小鼠肺組織中基因表達量的數(shù)據(jù)，經(jīng)過生物信息學方法計算分析后，得到了各處理組小鼠肺組織基因表達網(wǎng)絡指紋圖，構建了流感病毒感染小鼠“癥候網(wǎng)絡”。通過分析“癥候網(wǎng)絡”發(fā)現(xiàn)感染流感病毒后，小鼠體內(nèi)JAK/STAT、PI3K/Akt、抗原加工與提呈、腸道免疫等通

4、路受到抑制，而腎上腺素能通路、唾液分泌和胃酸分泌被活化。為了說明流感病毒感染小鼠“癥候網(wǎng)絡”的可靠性，本文通過實時熒光 PCR和蛋白免疫印跡的方法對網(wǎng)絡中的一些靶點進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在感染流感病毒后小鼠肺組織中 Saa1、Iigp1、Ms4a6d、Oasl2、Sectm1a、Gbp6、Plac8、Gbp11等基因相對表達量顯著增加，與“癥候網(wǎng)絡”的分析結(jié)果一致。小鼠感染甲型流感病毒后，小鼠肺組織中 Gbp6蛋白水平隨著時間延長而減少

5、，Iigp1蛋白水平隨著時間延長而增加， Oasl2蛋白表達水平先下調(diào)而后逐漸上調(diào)。本文選取蛋白水平變化明顯的Gbp6、Iigp1和 Oasl2作為靶點，設計了它們的反義核酸。將反義核酸腹腔注射到小鼠體內(nèi)，觀察這三個靶點的反義核酸對流感病毒感染小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)Iigp1反義核酸組（i.p.，5mg/kg）小鼠存活20％，Iigp1反義核酸組（i.p.，20mg/kg、10mg/kg）全部死亡，Oasl2反義核酸組（i.p.，10mg/k

6、g、5mg/kg）小鼠存活10%，Oasl2反義核酸組（i.p.，20mg/kg）小鼠全部死亡。本文又選取了基因Oasl2作為研究目標，利用小干擾沉默和質(zhì)粒過表達技術研究Oasl2與甲型流感病毒復制的關系。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)氣管接受Si-Oasl2后小鼠肺組織中Oasl2基因和蛋白表達水平都顯著下調(diào)，其肺組織中M基因的相對表達量與陰性對照組比較顯著上調(diào)，HA蛋白的表達水平出現(xiàn)上調(diào)，且流感病毒的病毒滴度增加；當A549細胞中 Oasl2表達

7、上調(diào)時，細胞中M基因相對表達量下調(diào)，HA蛋白表達水平下調(diào)，且培養(yǎng)基上清中病毒滴度也降低。
　　2、銀翹散是由9味中藥組成的，金銀花和連翹構成了處方的君藥，薄荷、牛蒡子、荊芥和淡豆豉構成了處方的臣藥，竹葉和桔梗構成了處方的佐藥，甘草是處方的使藥，本文將銀翹散的君臣佐使重新進行配伍組合，分別是君臣佐、君臣使、君佐使和君臣配伍，灌胃感染甲型流感病毒感染的小鼠，在造模成功后第3、5天摘取小鼠的肺組織并提取肺組織中的總RNA，通過高通量測序

8、的手段獲得小鼠肺組織中基因表達量的數(shù)據(jù)，經(jīng)過生物信息學方法計算分析后，結(jié)合第一部分流感病毒感染小鼠“癥候網(wǎng)絡”模型，綜合分析后發(fā)現(xiàn)銀翹散能使JAK-STAT和抗原加工與提呈通路的抑制水平得到緩解、降低凋亡通路活性程度。為了證實構建的網(wǎng)絡的可靠性，本文選取了JAK/STAT和PI3K/Akt兩條通路作為靶點，利用實時熒光 PCR法和蛋白免疫印跡法研究了銀翹散及其拆方對這兩條通路的影響，發(fā)現(xiàn)君臣佐、君臣使、君佐使和君臣配伍組對JAK/STA

9、T和PI3K/Akt等通路的改變起到恢復作用，這與獲得的網(wǎng)絡分析結(jié)果一致，說明了構建網(wǎng)絡方法及結(jié)果的可靠性。
　　3、本文研究了銀翹散中各味藥的主要化學成分對流感病毒感染小鼠存活率的影響，發(fā)現(xiàn)連翹苷對流感病毒感染小鼠具有一定的保護作用。連翹是銀翹散中的君藥，而連翹苷又是連翹中的主要成分之一，本文探討了連翹苷對甲型流感病毒感染小鼠的保護作用，為銀翹散抗流感作用機制提供支持。首先通過連翹苷對小鼠存活率和平均存活時間的影響觀察連翹苷對流

10、感病毒感染小鼠的保護作用；然后通過小鼠肺指數(shù)、小鼠血清中細胞因子的濃度和小鼠肺組織病理變化等三個指標研究了連翹苷對流感病毒感染小鼠肺組織炎癥的影響；另外通過小鼠肺組織中M基因的相對表達量、HA蛋白的表達水平和流感病毒病毒滴度研究了連翹苷對小鼠肺組織中流感病毒復制的影響；最后利用拉曼技術研究了連翹苷對小鼠血清中代謝產(chǎn)物的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，與模型組比較：連翹苷（i.p.，20mg/kg）提高小鼠存活率20%，并顯著延長小鼠平均存活時間至8.7

11、天，減緩小鼠因感染流感病毒導致的體重減輕；與模型組比較，小鼠在感染流感病毒后第5天，連翹苷能顯著降低小鼠的肺指數(shù)和小鼠血清中IL-6和GM-CSF的濃度，在流感病毒感染小鼠后第3天和第5天，連翹苷能減輕小鼠肺部炎癥細胞浸潤，使小鼠肺部肺泡腔內(nèi)分泌物較少，減輕流感病毒感染小鼠的肺損傷；在流感病毒感染小鼠第5天，連翹苷（i.p，20mg/kg）顯著降低小鼠肺部HA蛋白的表達水平和小鼠肺組織中流感病毒的病毒滴度。
　　本文利用網(wǎng)絡藥理學