抗真菌化合物bacilysin的制備、抑菌機(jī)制研究及結(jié)構(gòu)改造的探索.pdf

1、作者篩選得到一株能顯著抑制白色假絲酵母(Candida albicans)生長的菌株，通過測序確定其為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens ZJU-2011)。論文首先在5L罐中進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，確定發(fā)酵條件為:通氣量500 L/h，攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，接種量10％(v/v)，裝液量為60％(v/v)?？拐婢r在30h時達(dá)到了6.9×103 U/mL。進(jìn)一步對工藝進(jìn)行3T罐放大，效價達(dá)到了8.5

2、×103 U/mL。在此基礎(chǔ)上采用色譜技術(shù)對抗真菌化合物進(jìn)行分離純化，首先利用乙醇沉淀和大孔樹脂吸附去除了可溶物中約84.6％的雜質(zhì)。再通過反相層析獲得抗真菌有效部位，迸一步通過凝膠過濾層析，得到兩個高純度的組分。最后利用MS和NMR確定這兩個抗真菌化合物為bacilysin和chlorotetaine。隨后開發(fā)了一條適合于規(guī)模化提取bacilysin的低壓色譜工藝，產(chǎn)品回收率達(dá)到76％以上，純度達(dá)到95％。
　　體外抑菌試驗(yàn)測定

3、了bacilysin對6株常見病原真菌的最低抑菌濃度(MICs)，結(jié)果表明他們對試驗(yàn)菌株具有明顯的抑制效果(MICs在0.9-7.8μg/mL之間)，其中對克魯氏假絲酵母抑制效果最佳。急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示bacilysin對昆明種小鼠的半致死量(LD50)達(dá)到135.3 g(bacilysin)/kg。體外肝微粒代謝實(shí)驗(yàn)擬合了bacilysin的代謝模型。
　　為了明確bacilysin的抑菌機(jī)理，對來源于Candida albica

4、ns的靶酶-葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(Gfa)實(shí)現(xiàn)了高效異源表達(dá)。通過比較發(fā)現(xiàn)N末端的標(biāo)簽會嚴(yán)重影響其轉(zhuǎn)氨酶的活性，并且bacilysin對C-His Gfa的轉(zhuǎn)氨酶活性抑制效果更強(qiáng)，而對N-His Gfa的抑制作用則顯著變?nèi)?。反?yīng)動力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn):bacilysin與靶酶之間的相互作用是一個線性混合型抑制反應(yīng)。bacilysin能夠直接與靶酶發(fā)生作用，抑制其轉(zhuǎn)氨酶活性。
　　進(jìn)一步，通過分子模擬對bacilysin抑菌機(jī)理進(jìn)行了

5、模擬。首先，對構(gòu)成bacilysin的非蛋白質(zhì)氨基酸-anticapsin和bacilysin的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程進(jìn)行了模擬。通過對接發(fā)現(xiàn)bacilysin能夠以合理的構(gòu)型穩(wěn)定地存在于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的內(nèi)部，而anticapsin不能與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生有效的作用。動力學(xué)模擬顯示，當(dāng)體系達(dá)到平衡狀態(tài)時，bacilysin能與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物。特別的是，僅在bacilysin與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)了影響轉(zhuǎn)運(yùn)的鹽橋(Glu403與配體的N末端氨

6、基之間)。其次，對anticapsin和bacilysin與Gfa之間的相互作用進(jìn)行了模擬。通過對接發(fā)現(xiàn)bacilysin和anticapsin都能在Gfa轉(zhuǎn)氨酶的活性中心以一種相對合理的構(gòu)型存在。該過程的動力學(xué)模擬顯示整個的過程中bacilysin與Gfa的相互作用更強(qiáng)。當(dāng)體系達(dá)到平衡時:Gfa的催化殘基Cys會朝向bacilysin發(fā)生一定角度的偏轉(zhuǎn)，然后Cys上的-SH會對bacilysin中羰基C進(jìn)行親核攻擊，形成C-S共價鍵。

7、由此可以認(rèn)為bacilysin由于更加高效的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率導(dǎo)致了其比anticapsin更高的抗真菌活性。
　　最后，論文構(gòu)建了一個能特異性無痕敲除ZJU-2011中bacD基因的復(fù)制型質(zhì)粒-pBAC-CE以高效生產(chǎn)anticapsin。通過對ZJU-2011的感受態(tài)制備以及其電轉(zhuǎn)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳電轉(zhuǎn)條件:菌體OD6000.8-0.9，電場強(qiáng)度2.5 kV，電阻200 Q，復(fù)壯時間4h。在此條件下，將經(jīng)過SacI線性化的pBA