TMEM63A在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖結(jié)合凝集素調(diào)節(jié)山羊外周血單個核細胞功能中的作用.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是牛羊等反芻動物重要的腸道寄生性線蟲。它寄生在牛羊等宿主動物真胃及小腸內(nèi)，靠吸食宿主血液為生。感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲能夠引起宿主免疫功能低下，造成宿主貧血、消瘦及死亡，死亡多發(fā)生于羔羊。給世界范圍內(nèi)畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。
　　Hco-gal-m(Acc.No.AY253330)和Hco-gal-f(Acc.No.AY253331)是由本實驗室首次發(fā)現(xiàn)，分離，體外克隆表達的，分別來自于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌蟲和雄蟲的半乳糖結(jié)合凝集素

2、。本實驗室目前研究表明，重組Hco-gal-m/f(rHco-gal-m/f)能夠以劑量依賴方式誘導細胞凋亡，降低細胞遷移能力，減少氧自由基釋放，降低NO產(chǎn)量和細胞因子水平。當用rHco-gal-m/f免疫山羊時，會出現(xiàn)糞便內(nèi)蟲卵量降低，山羊體內(nèi)蟲體減少，IgG水平上升等變化。而跨膜蛋白63A(TMEM63A)是Ⅳ型跨膜蛋白。進一步研究證明，TMEM63A在大多數(shù)山羊外周血單個核細胞上表達，參與細胞因子調(diào)節(jié)。然而，目前TMEM63A只在

3、為數(shù)不多的幾種哺乳動物上發(fā)現(xiàn)，其功能均未知。本實驗室通過大量實驗證實了TMEM63A是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖結(jié)合凝集素在山羊外周血單個核細胞上的受體或結(jié)合蛋白。本文使用抗體封閉技術(shù)、RNA干擾技術(shù)研究TMEM63A對Hco-gal-m/f調(diào)節(jié)PBMCs（單核細胞）增殖、遷移、吞噬以及NO分泌功能的影響。
　　1.TMEM63A-Ⅰ原核克隆表達
　　由于TMEM63A是一個多次跨膜蛋白，且疏水性較強，不能以整體的形式在原核表達系統(tǒng)

4、中表達。我們選擇TMEM63A最長膜內(nèi)區(qū)片段TMEM63A-Ⅰ作為目的片段進行克隆表達。TMEM63A-Ⅰ全長648bp。對其進行生物學信息分析，發(fā)現(xiàn)此片段疏水性較弱，有B細胞作用位點。首先將TMEM63A-Ⅰ重組進入pMD18-T載體，用以TMEM63A-Ⅰ基因片段保存。經(jīng)測序分析，發(fā)現(xiàn)載體中TMEM63A-Ⅰ基因片段與NCBI中該片段同源性達100％。隨后，構(gòu)建表達載體pET-28a-TMEM63A-Ⅰ，并將其轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21，

5、構(gòu)建表達菌株BL21-pET-28a-TMEM63A-Ⅰ。用IPTG誘導5h，收集菌液。SDS-PAGE分析顯示，表達蛋白25KD大小，存在于包涵體中。用鎳柱純化蛋白。
　　2.多克隆抗體制備
　　用腸激酶切去純化后蛋白上的載體標簽，收集無標簽純化蛋白，測濃度后分裝保存。用無標簽純化蛋白與弗氏佐劑混成乳濁液，多次免疫大鼠。收集免疫大鼠血清，用飽和硫酸銨純化法純化多克隆抗體anti-63-IP。用免疫共沉淀方法驗證多克隆抗體a

6、nti-63-IP的特異性。Western blot結(jié)果顯示，anti-63-IP能夠特異性識別天然構(gòu)象TMEM63A。用間接ELISA方法檢測多克隆抗體效價。
　　3.TMEM63A在Hco-gal-m/f調(diào)節(jié)PBMCs功能中的影響
　　抗體封閉技術(shù)實驗結(jié)果顯示，單獨用40μg/mLHco-gal-m/f與PBMCs（或單核細胞）共孵育，同單獨細胞對照組相比，PBMCs（或單核細胞）的增殖能力、NO分泌能力、遷移能力被抑制

7、。說明Hco-gal-m/f可以抑制PBMCs（或單核細胞）的增殖能力、NO分泌能力和遷移能力。用濃度為2ug/mL的TMEM63A特異性抗體anti-63A IgG和40μg/mLHco-gal-m/f與PBMCs（或單核細胞）共孵育，同用40μg/mLHco-gal-m/f共孵育組相比，PBMCs（或單核細胞）的增殖能力、NO分泌能力、遷移能力明顯提高，但與單獨細胞對照組相比，PBMCs（或單核細胞）的增殖能力、NO分泌能力、遷移能

8、力變化不明顯。用濃度為2ug/mL的非特性性抗體Neg A IgG和40μg/mLHco-gal-m/f與細胞共孵育，同40μg/mLHco-gal-m/f共孵育組相比，細胞增殖能力、吞噬能力、NO分泌能力、遷移能力無顯著改變。說明特異性抗體anti-63A IgG可以阻斷Hco-gal-m/f與受體TMEM63A的結(jié)合，進而阻斷Hco-gal-m/f對細胞功能的影響。RNA干擾技術(shù)研究結(jié)果顯示，用特異性TMEM63A干擾RNATMEM