甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)低RA苷優(yōu)選單株獲得及相關基因的表達調控研究.pdf

1、甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）因其葉片可提取高甜度（甜度約為蔗糖的250～450倍）、低熱量（熱量僅為蔗糖的1/300）的甜菊糖苷而備受關注。除了作為甜味劑使用，越來越多的研究表明甜菊糖苷還具有預防和治療肥胖癥、糖尿病、高血壓、高血糖以及消炎、抗氧化、抗菌、抗癌和增強免疫力等藥用價值。甜菊葉片所含甜菊糖苷有多達30種組分，各種組分因為連接在苷元甜菊醇上的糖基種類和數量不同，其甜度、味質、生物活性等性能迥異。其

2、中甜菊苷(Stevioside，ST)和萊鮑迪苷A(Rebaudioside A，RA)為兩大主要組分，占總糖苷含量的60～80％。ST苷的甜度為蔗糖的250～300倍，略帶苦味，具有藥用價值;RA苷的甜度為蔗糖的350～450倍，具有更接近蔗糖的甜味。因此為了滿足不同需要，提高單一糖苷組分含量是甜菊育種的目標之一。
　　本論文主要包括兩部分研究內容:一、通過對甜菊雜交后代的篩選獲得一個ST苷含量較高而RA苷含量近缺失的優(yōu)異單株，

3、并以ST苷向RA苷轉化過程中的關鍵基因SrUGT76G1為著眼點，從基因和蛋白質水平探尋了該單株RA含量極低的原因;二、分別采用RT-PCR半定量和熒光定量PCR的方法分析了甜菊糖苷合成途徑15個相關基因的轉錄水平和關鍵基因SrUGT76G1的表達特性，并通過SrUGT76G1基因啟動子的克隆和序列分析研究了該基因的表達調控模式。主要研究內容和結果如下:
　　1、通過高效液相色譜法對甜菊品種‘中山3號’、‘中山4號’（簡寫為Z03

4、、Z04）及兩者自然雜交得到的37個F1代單株進行了ST苷和RA苷含量（干葉質量比）測定，結果表明ST苷含量變化范圍為1.18％～9.83％;RA苷含量變化范圍為5.15％～15.36％;ST苷和RA苷的總含量變化范圍為10.26％～19.67％;RA苷與兩苷總含量比值的變化范圍為34％～90.42％，均近似服從正態(tài)分布。在所測樣品中，雜交后代單株011的糖苷含量測定結果與親本及其他單株差異較大，其ST苷和RA苷的總含量為干葉質量的16

5、.29％，ST苷含量為15.9％，而RA苷含量僅0.4％，這在同期測定的其他甜菊品種及雜交后代等約500個樣品中也是罕見的。隨后將單株011定名為‘中山5號’，簡寫為Z05。
　　2、根據前人對甜菊糖苷生物合成途徑的研究，已經明確尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶SrUGT76G1催化甜菊醇C-13位C-3'的糖基化，將ST苷轉化為RA苷，因此本研究從RA苷含量較高的Z04和低RA苷含量的Z05中分別克隆SrUGT76G1基因，通過序列比對

6、分析，探尋Z05葉片ST苷含量較高而RA苷含量近缺失的原因。結果發(fā)現單株Z05的SrUGT76G1基因DNA序列中存在一個雜合的無義突變c.389T＞G(p.L121 X)，同時在該基因的另一個拷貝中存在一些導致蛋白質結構改變的堿基替換。為了進一步驗證這些堿基突變對酶功能的影響，本試驗以Z04和Z05葉片中的葡萄糖基轉移酶粗提液進行體外酶反應，以ST苷標準品為反應底物，尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)為糖基供體，以RA苷的產出量為標準，比較

7、Z04和Z05的SrUGT76G1酶活性。液相色譜測定結果顯示來自Z04葉片的酶液反應后有RA苷色譜峰出現，而Z05葉片提取的酶液反應后沒有可見的RA苷色譜峰，由此認為發(fā)生在Z05 SrUGT76G1基因中的序列突變確實導致了酶功能的下降。
　　3、為了了解甜菊糖苷合成相關基因的表達特性，試驗同時對甜菊糖苷生物合成途徑中15個相關基因進行了RT-PCR半定量分析，研究了不同溫度(15℃、25℃、35℃)、水分脅迫、光周期(8L/1

8、6D、10L/14D、14L/10D、16L/8D，L=Light、D=Dark)、和不同生長階段對相關基因轉錄水平的影響，并對各處理下甜菊葉片中的甜菊糖苷含量進行了HPLC法測定。15個甜菊糖苷合成相關基因的半定量分析結果表明在25℃處理下各個基因的轉錄水平較高;其中基因SrDXS、SrDXR、SrMCT、SrCMK、SrMDS、SrHDS、SrHDR、SrID1、SrGGDPS、SrCPPS1、SrUGT85C2和SrUGT76G1

9、在15℃和35℃處理下轉錄受一定程度的抑制;干旱處理抑制了糖苷合成相關的大部分基因的轉錄;不同生長階段對基因的轉錄水平影響較大，在快速生長期15個基因的轉錄水平均相對較低;基因SrDXS、SrDXR、SrMDS、SrHDR、SrGGDPS、SrKS1-1和SrUGT74G1在現蕾期轉錄水平最高;開花期時SrCMK、SrIDI、SrKO1和SrUGT85C2基因的轉錄水平比現蕾期有所增加，在15個基因中只有SrMCT、SrHDS、SrCP

10、PS1和SrUGT76G1的轉錄水平在現蕾期和開花期沒有顯著差異。糖苷含量測定結果表明隨著植株的生長發(fā)育葉片中糖苷含量逐漸增加，至現蕾期達到高峰，開花后則下降。
　　4、SrUGT76G1基因相對表達量的熒光定量PCR分析結果表明16小時的長日照處理下SrUGT76G1的相對表達量是短日照處理下的7.42倍;處于快速生長期、現蕾期和開花期的葉片SrUGT76G1相對表達量分別為對照的0.41倍、0.72倍和82.74倍，可見SrU

11、GT76G1表達量受光照周期和植株個體發(fā)育的影響較大。在一天中以4:00所取葉片為對照，8:00葉片中SrUGT76G1平均相對表達量為對照的1.64倍;12:00時SrUGT76G1相對表達量上升為對照的1699.75倍;16:00、20:00和24:00時葉片SrUGT76G1的相對表達量分別為對照的69.25倍、24.94倍和24.60倍。
　　5、為了進一步了解SrUGT76G1基因的表達調控模式，本試驗采用hiTAIL-

12、PCR的方法克隆到SrUGT76G1翻譯起始位點上游2283 bp的啟動子序列。利用PlantCARE、PLACE等在線工具分析該段序列，發(fā)現有475個順式調控元件，除了TATA-box、CAAT-box、MYB結合位點等保守元件，還有光等環(huán)境因子響應元件、植物激素響應元件和組織特異性表達元件等。通過克隆SrUGT76G1轉錄起始位點上游1989bp帶酶切位點的序列，將其替換植物表達載體pCAMBIA1301-220中的CaMV35S啟