酒精誘導(dǎo)小鼠生精細(xì)胞的凋亡及其對survivin和caspase-3表達(dá)的影響.pdf

1、目的：研究酒精灌胃對小鼠生長發(fā)育、睪丸及生精功能的影響，了解制備小鼠睪丸石蠟切片、HE染色等技術(shù)。掌握原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測生精細(xì)胞凋亡和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)對標(biāo)本的檢測，來探討各實驗組Caspase-3蛋白和Survivin蛋白的表達(dá)情況以及與酒精所引起的生精細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。
　　 方法：本實驗分別以蒸餾水、紅葡萄酒、低劑量和高劑量白酒給予小鼠按0.01ml/g灌胃。實驗期間每周測量小鼠體重并觀察各組小鼠生長發(fā)

2、育和酒精所引起的狀態(tài)變化。經(jīng)3生精周期，成功建立小鼠酒精毒性模型。斷頭處死小鼠并立即測量雙側(cè)睪丸重量等。制備小鼠睪丸的石蠟切片，利用HE染色觀察各組小鼠睪丸曲細(xì)精管和生精細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并利用原位缺口末端標(biāo)記法檢測各組生精細(xì)胞的凋亡指數(shù)(AI)變化。然后應(yīng)用免疫組化SP法檢測Caspase-3蛋白和Survivin蛋白在各實驗組的表達(dá)情況，采用免疫反應(yīng)評分(immunoreactivity score，IRS)進(jìn)行半定量分析，即IRS：

3、0分：陰性(-)，1～4分：弱陽性(+)，5～8分：中度陽性(++)，9～12分：強(qiáng)陽性(+++)。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理，即計量資料進(jìn)行方差分析、等級資料進(jìn)行非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗，兩變量之間的關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)分析法等，對各實驗組小鼠體重、睪丸等重量及生精細(xì)胞凋亡指數(shù)、Caspase-3蛋白和Survivin蛋白表達(dá)情況統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果：本實驗以0.01mL/g

4、酒精灌胃約3個生精周期后，成功建立小鼠酒精毒性模型。實驗期間對照組和葡萄酒組小鼠食欲正常，精神狀態(tài)好，白酒灌胃組小鼠出現(xiàn)醉酒現(xiàn)象。紅葡萄酒灌胃組小鼠平均體重增加最多，而高劑量白酒灌胃組增加最少，從各組小鼠平均體重增加變化來看，其中高劑量白酒灌胃小鼠體重增加明顯小于低劑量組的小鼠((P=0.003)，隨著白酒劑量的增加，小鼠體重增加越不明顯。同時檢測各組小鼠睪丸的相對重量(雙側(cè)睪丸相對于實驗前小鼠自身體重)和HE染色下曲細(xì)精管的直徑的變化

5、，也呈現(xiàn)基本一致性的結(jié)果。利用TUNEL檢測各組小鼠生精細(xì)胞凋亡指數(shù)，蒸餾水灌胃組生精細(xì)胞平均凋亡指數(shù)為0.1394±0.0104，高于紅葡萄酒組(0.1016±0.0124，P=0.000)，而低于白酒灌胃組(0.2213±0.0149、0.2582±0.0177，分別為P=0.000，P=0.000)，其中紅葡萄酒組生精細(xì)胞平均凋亡指數(shù)最低，高劑量白酒組最高，且隨之白酒劑量的增加生精細(xì)胞平均凋亡指數(shù)也逐漸增多。免疫組化結(jié)果顯示白酒灌

6、胃組小鼠睪丸Caspase-3蛋白的表達(dá)較對照組和紅葡萄酒組較高，且隨著酒精劑量的增加其表達(dá)越強(qiáng)；Survivn蛋白的表達(dá)恰恰相反。而葡萄酒組小鼠睪丸Caspase-3蛋白的表達(dá)低于其他各組，甚至低于正常對照組，Survivin蛋白的陽性表達(dá)則最顯著。隨著各組小鼠生精細(xì)胞凋亡程度的增加，Caspase-3蛋白的表達(dá)越強(qiáng)，呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.717，P<0.01)；而Survivn蛋白表達(dá)越弱，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.631，P<0.0