熱激、低氧及JA和ABA調(diào)控西蘭花芽苗蘿卜硫素形成機(jī)理.pdf

1、西蘭花中硫代葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱硫苷）是一類含氮和硫的次生代謝產(chǎn)物，其在黑芥子酶(MYR)作用下生成異硫氰酸酯、硫氰酸鹽、腈類和2-S惡唑烷等。蘿卜硫苷(GRA)是西蘭花中含量最多的硫苷，占總硫苷的50％以上，在MYR作用下水解，生成蘿卜硫素。蘿卜硫素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗癌作用最強(qiáng)的天然植物活性成分。然而，當(dāng)表皮特異硫蛋白(ESP)存在時(shí)，GRA會(huì)朝著沒(méi)有抗癌功能的蘿卜硫腈方向水解，降低蘿卜硫素產(chǎn)量。因此，蘿卜硫素形成量與GRA含量、MYR和E

2、SP蛋白活性有關(guān)。GRA和蘿卜硫素在西蘭花種子和芽苗中含量較多，西蘭花芽苗中GRA和蘿卜硫素含量是成熟西蘭花的10～100倍，因而西蘭花芽苗作為一種保健型蔬菜日益受到關(guān)注。植物在逆境條件下，硫苷會(huì)大量積累，脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)含量增加并緩解脅迫。JA作為信號(hào)分子在硫苷合成過(guò)程中起重要調(diào)控作用，而ABA作為逆境緩和激素調(diào)控硫苷的報(bào)道較少。本研究從生理代謝水平、酶水平、激素水平、基因水平和蛋白質(zhì)水平探討熱激、低氧脅迫及JA和AB

3、A處理調(diào)控西蘭花芽苗中GRA和蘿卜硫素的機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1、研究了西蘭花種子發(fā)芽過(guò)程中抗壞血酸、總酚、花色苷、抗氧化能力變化及硫苷、MYR和蘿卜硫素時(shí)空分布。西蘭花芽苗中抗壞血酸和花色苷含量在發(fā)芽0～7 d先增加后降低，總酚、GRA和蘿卜硫素含量不斷下降，MYR活性在0～3 d無(wú)顯著差異，隨后逐漸增強(qiáng)，第7天約增加到初始的3倍，抗氧化能力在第2天達(dá)到最高;GRA是西蘭花芽苗中含量最多的硫苷，約占總硫苷的70％，西蘭花

4、種子在25℃下發(fā)芽較20℃和30℃有利于GRA和蘿卜硫素的富集;GRA和蘿卜硫素在子葉中含量最多，占芽苗中GRA和蘿卜硫素含量的93％以上，但是子葉中MYR活性顯著低于胚軸和根;在西蘭花種子、芽苗、子葉及胚軸中含量最多的酶解產(chǎn)物均是蘿卜硫素，而根中主要的酶解產(chǎn)物是4-甲硫基丁腈和丁基異硫氰酸酯。
　　2、研究了熱激、低氧及其聯(lián)合脅迫對(duì)西蘭花芽苗生理代謝及GRA和蘿卜硫素的影響。熱激脅迫下，西蘭花芽苗中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧

5、化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)活性較對(duì)照顯著增加，而低氧脅迫下，芽苗中POD和GPX活性較對(duì)照顯著降低，SOD和CAT活性增加;聯(lián)合脅迫下西蘭花芽苗中SOD、CAT、POD和GPX活力低于熱激脅迫高于低氧脅迫;熱激處理下西蘭花芽苗的抗氧化能力最強(qiáng)，聯(lián)合脅迫次之，對(duì)照最低。ABA是西蘭花芽苗中含量最高的激素，JA次之;各脅迫處理顯著提高了西蘭花芽苗中JA、ABA和油菜素內(nèi)酯(BR)含量，對(duì)水楊酸(SA

6、)和赤霉素(GA)無(wú)顯著影響，降低了乙烯(ETH)含量。各脅迫處理顯著提高了西蘭花芽苗中3-丁烯基硫苷(GNA)、GRA和4-甲硫基丁基硫苷(GER)及總硫苷的積累，但是熱激聯(lián)合低氧脅迫并沒(méi)有顯示出熱激脅迫和低氧脅迫的協(xié)同疊加作用，熱激脅迫下西蘭花芽苗中GNA和GER含量低于低氧脅迫，聯(lián)合脅迫下各硫苷及總硫苷含量與低氧脅迫無(wú)顯著差異。熱激脅迫處理下，7d西蘭花芽苗中MYR和ESP蛋白活性較對(duì)照分別降低了39.41％和64.28％，低氧脅

7、迫處理下，7d芽苗中MYR活性較對(duì)照降低了11.90％，ESP蛋白活性提高了34.30％，聯(lián)合脅迫下，MYR活性與低氧脅迫無(wú)顯著差異，ESP蛋白活性與對(duì)照無(wú)顯著差異。熱激脅迫下西蘭花芽苗中蘿卜硫素形成量高于低氧及聯(lián)合脅迫，7d熱激脅迫的西蘭花芽苗中蘿卜硫素的形成量是對(duì)照的2.54倍、低氧的1.30倍。
　　3、研究了JA和ABA對(duì)西蘭花芽苗中GRA和蘿卜硫素的調(diào)節(jié)作用。西蘭花芽苗經(jīng)100μM JA處理后，7d芽苗中GRA和總硫苷含

8、量分別較對(duì)照平均提高了2.01倍和2.53倍;100μM JA處理提高了5d和7d芽苗中MYR活性，對(duì)ESP蛋白活性無(wú)顯著影響，200μM和300μM JA提高了各生長(zhǎng)階段芽苗MYR活性和ESP蛋白活性;在5d和7d芽苗中，100μM JA處理下蘿卜硫素含量是對(duì)照的1.95倍和3.36倍，高于300μM JA處理。對(duì)于各生長(zhǎng)階段的西蘭花芽苗，ABA處理后GRA和總硫苷含量顯著提高，但50μM和75μM ABA之間無(wú)顯著差異;噴施50μM

9、 ABA后，3d、5d和7d芽苗中GRA含量較對(duì)照分別增加了16.64％、62.52％和97.17％,總硫苷分別增加了18.58％、70.36％和109.61％; ABA提高了5d和7d芽苗MYR和ESP蛋白活性，ABA處理后西蘭花芽苗中蘿卜硫素形成量顯著提高，但是50μM和75μM之間無(wú)顯著差異。
　　4、采用RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技術(shù)，設(shè)計(jì)兼并引物、3'和5'端特異性引物，

10、克隆西蘭花芽苗CYP79F1、CYP83A1、UGT74B1、ST5b和FMOGS-OX1基因。將中間片段、上游及下游cDNA序列拼接得到1980 bp、1652 bp、1592 bp、1378bp和1623 bp的基因序列（包括部分內(nèi)含子）。運(yùn)用DNAStar和BioXM在線軟件分析序列，發(fā)現(xiàn)CYP79F1基因序列包含1623 bp的開放閱讀框，編碼540個(gè)氨基酸;CYP83A1基因序列包含1506 bp的開放閱讀框，編碼501個(gè)氨基

11、酸;UGT74B1基因序列包含1401 bp的開放閱讀框，編碼466個(gè)氨基酸;ST5b基因序列包含1029 bp的開放閱讀框，編碼342個(gè)氨基酸;FMOGS-OX1基因序列包含1386 bp的開放閱讀框，編碼461個(gè)氨基酸。
　　5、熱激脅迫下，西蘭花芽苗中GRA合成基因Elong、 CYP83A1和FMOGS-OX1的表達(dá)顯著上調(diào)，蘿卜硫素形成基因MYR和ESP的表達(dá)降低;通過(guò)蛋白組學(xué)分析，成功鑒定出146個(gè)差異表達(dá)蛋白，這些差

12、異蛋白主要涉及防御、蛋白質(zhì)合成、能量、碳水化合物代謝、氨基酸代謝和次生代謝等功能，分布于葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核等部位。熱激脅迫降低了西蘭花芽苗中S-腺苷甲硫氨酸合成酶1(SAM1)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶2(SAM2)和S-腺苷甲硫氨酸合成酶4(SAM4)的表達(dá)，提高了3-異丙基蘋果酸脫氫酶(IPMDH)、3-異丙基蘋果酸脫氫酶大亞基(IIL1)和3-異丙基蘋果酸脫氫酶小亞基3(IPMDS3)的蛋白表達(dá)，降低了ESP蛋白和腈特異

13、蛋白2(NSP2)的表達(dá)。
　　6、低氧及聯(lián)合脅迫下，西蘭花芽苗中GRA合成基因Elong、CYP83A1、UGT74B1、ST5b和AOP2的表達(dá)顯著上調(diào)，因此西蘭花芽苗經(jīng)低氧及聯(lián)合脅迫處理后，GER和GNA含量顯著高于熱激處理，低氧及聯(lián)合脅迫提高了芽苗中MYR和ESP基因表達(dá)。西蘭花芽苗經(jīng)低氧脅迫后鑒定出91個(gè)差異表達(dá)蛋白，聯(lián)合脅迫與熱激脅迫相比，檢測(cè)到106個(gè)差異蛋白，與低氧脅迫相比僅檢測(cè)到19個(gè)差異蛋白;低氧及聯(lián)合脅迫降低

14、了SAM1和SAM2的蛋白表達(dá)，提高了IIL1和IPMDS3蛋白表達(dá)，低氧脅迫對(duì)黑芥子酶MYR1和MYR2的蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響，提高了ESP蛋白表達(dá);聯(lián)合脅迫對(duì)MYR1、MYR2、ESP和NSP2的蛋白表達(dá)均無(wú)顯著影響。
　　7、西蘭花芽苗經(jīng)JA處理后，檢測(cè)到差異蛋白126個(gè)，經(jīng)ABA處理后，鑒定出102個(gè)差異蛋白;這些差異蛋白主要參與防御功能、能量、蛋白質(zhì)合成、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)折疊和降解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及次生代謝等

15、過(guò)程，分布于葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位。JA和ABA顯著提高了西蘭花芽苗中脂肪族硫苷合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MYB28及相關(guān)基因Elong、 CYP79F1、CYP83A1、UGT74B1、ST5b、FMOGS-OX1和AOP2的表達(dá)，JA提高了IIL1和IPMDS3蛋白表達(dá)，ABA提高了IPMDH和IPMDS3蛋白表達(dá)，從而增加了GRA的積累;JA提高了5d芽苗MYR基因表達(dá)及MYR1和MYR2蛋白表達(dá)，對(duì)ESP基因表達(dá)和