PRRS耐熱糖玻璃疫苗制備工藝的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以感染豬發(fā)熱、厭食，妊娠母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎和木乃伊胎，各種年齡豬（特別是仔豬）呼吸障礙為特征的高度傳染性疾病，對養(yǎng)豬業(yè)造成重大危害，免疫注射活疫苗是預(yù)防該病最有效的方法之一。目前國內(nèi)外的活疫苗生產(chǎn)主要是采用真空冷凍干燥技術(shù)，在2～8℃條件下保存1.5-2年，保存、運輸及使用均需要依賴“冷鏈”系統(tǒng)。本研究采用新型梯度真空泡沫干燥方法，研究以海藻糖

2、等為主要成分的PRRS耐熱糖玻璃疫苗，以期獲得更高的耐熱儲存性能，能夠擺脫“冷鏈”依賴的高品質(zhì)疫苗。研究首先對海藻糖、蔗糖、胰蛋白胨、EDTA、明膠等成分進行耐熱配方單因素分析，以37℃耐老化試驗、殘余水份為篩選指標，獲得最佳配方;再對泡沫干燥疫苗的形態(tài)結(jié)構(gòu)、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度等進行工藝參數(shù)優(yōu)化;最后通過保存期和免疫效果確立PRRS耐熱糖玻璃疫苗的實驗室制備工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。
　　1.泡沫干燥疫苗保護劑配方的篩選

3、　　為了挑選耐熱性能較好的保護劑，試驗選取了蔗糖、海藻糖、明膠、胰蛋白胨等成分，采用單因素設(shè)計進行成分的添加與配伍，在相同的真空干燥程序下，進行真空泡沫干燥疫苗的制備。將干燥制品進行37℃耐老化試驗，首先發(fā)現(xiàn)T28配方泡沫干燥疫苗10d的耐老化損失低于0.5 Lg，優(yōu)于其他配方。然后在此基礎(chǔ)上繼續(xù)優(yōu)化得到T28C-1、T28C-5、T28C-6、T28C-8配方，制備的泡沫干燥疫苗37℃保存10 d的耐老化損失Lg值分別是0.43、0.

4、30、0.44和0.38。
　　2.泡沫干燥疫苗制備程序的優(yōu)化
　　泡沫干燥工藝不僅影響疫苗的物理性狀，也影響疫苗制備過程中的效價損失和耐熱性能。本研究在原有新城疫泡沫干燥工藝的基礎(chǔ)上進行調(diào)整，得到初篩結(jié)果較好的T28基礎(chǔ)耐熱配方，能夠穩(wěn)定形成泡沫并保持較低的病毒滴度損失;進一步調(diào)整不同的分液量、控制隔板溫度和真空下降速率制備泡沫干燥疫苗，挑選得到T28C耐熱疫苗，并對不同泡沫形態(tài)的疫苗進行物理性狀與耐熱活性比較，發(fā)現(xiàn)不同形

5、態(tài)泡沫干燥疫苗的病毒TCID50差異不大，同一批次泡沫干燥疫苗中形成較膨脹的泡沫、泡沫體積大于瓶高1/2且形態(tài)較為規(guī)則、無沾壁現(xiàn)象的疫苗病毒滴度檢測Lg值是6.7±0.08;有沾壁現(xiàn)象、泡沫形態(tài)不規(guī)則、雜亂的疫苗病毒滴度檢測Lg值是6.5±0.11;泡沫未完全膨脹開、聚在瓶底的疫苗病毒滴度檢測Lg值是6.6±0.07。
　　3.泡沫干燥疫苗理化特性的研究
　　結(jié)合前兩章成功獲得最佳配方和制備工藝，在實驗室試制了幾批PRRS泡

6、沫干燥疫苗，所得到的T28C系列耐熱保護劑疫苗呈現(xiàn)了致密的乳白色泡沫狀，具有泡沫疏松、高度較為均一（達到1/2瓶～2/3瓶高）、表面積大有利于水分蒸發(fā)等特點，并從微觀上進行掃描電鏡的圖片展示;參考《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》相關(guān)方法進行了外觀性狀、殘余水分、耐老化試驗等測定，T28C-1、T28C-5、T28C-6和T28C-8配方的殘余水分為2.9％、2.86％、2.94％、2.88％，均低于3％，能夠更好地保存，結(jié)合對37℃1

7、0d的耐老化試驗結(jié)果T28C-1、T28C-5、T28C-6和T28C-8配方制備的泡沫干燥疫苗在37℃保存10d的耐老化損失Lg值分別是0.43、0.3、0.44、0.38，可以挑選出T28C-5、T28C-6為最佳配方;同時通過T28C-5、T28C-6配方制備的泡沫干燥疫苗測定玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)，得到與病毒液配苗后的液體狀態(tài)下分別是-33.68℃、-33.82℃，經(jīng)泡沫干燥工藝制備的PRRS干燥疫苗分別是56.1℃、57.45

8、℃，比凍干商品苗的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高12℃。
　　4.泡沫干燥疫苗的質(zhì)量研究
　　為了更好地檢測泡沫干燥疫苗的耐熱性能，將實驗室制品放置4℃、25℃、37℃和室溫等多種環(huán)境，定期進行病毒含量和殘余水分的體外測定，確定疫苗的保存條件和保存期;同時進行體內(nèi)免疫學測定，評價疫苗的免疫效果。結(jié)果表明，T28C-1、T28C-8配方分別在37℃80 d、25℃120 d、自然環(huán)境下保存120 d之后病毒滴度損失均超過1.0 Lg，而采用

9、T28C-5、T28C-6配方制備的PRRS泡沫干燥疫苗在37℃保存4個月，病毒滴度損失＜1.0 Lg;在25℃保存150天，病毒滴度損失仍然＜0.8 Lg;在自然環(huán)境下保存150 d病毒滴度損失仍然＜0.6 Lg。綜合得到T28C-5配方展現(xiàn)出顯著的耐熱性能。進一步的體內(nèi)試驗結(jié)果表明，T28C-5泡沫干燥疫苗在37℃、25℃和4℃分別保存3個月后免疫仔豬，免后2周、3周、4周后采血進行ELISA測定?？贵w水平檢測呈較高的陽性水平，4℃