SUMO化修飾參與活動依賴刺激過程及異丙酚抗氧化效應(yīng).pdf

1、第一部分
　　 活動依賴刺激上調(diào)SHSY5Y細(xì)胞整體SUMO化修飾及其機(jī)制的研究
　　 研究背景:
　　 SUMO化修飾是近年來發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾。已有越來越多的證據(jù)表明,SUMO化修飾在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用,但有關(guān)其在麻醉相關(guān)領(lǐng)域中的作用研究,目前還是一片空白。麻醉及其相關(guān)領(lǐng)域研究的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)是神經(jīng)元。而活動依賴刺激(Activity-Dependentstimuli)在調(diào)節(jié)神經(jīng)元數(shù)目和功能中發(fā)

2、揮重要作用,參與了麻醉相關(guān)的各個領(lǐng)域,如全麻藥物的作用機(jī)理,疼痛的發(fā)生機(jī)制等。因此,探討整體SUMO化修飾在活動依賴刺激中的作用機(jī)制,將有可能為今后進(jìn)一步研究SUMO化修飾這一蛋白質(zhì)翻譯后修飾在麻醉相關(guān)領(lǐng)域中的作用奠定基礎(chǔ)。有鑒于此,本研究擬以逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)構(gòu)建分別表達(dá)Flag-SUMO1、Flag-SUMO2、Flag-SUMO3的SHSY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,通過氯化鉀引起的去極化刺激作為活動依賴刺激,觀察上述三株細(xì)胞受刺激后Flag-S

3、UMO1、Flag-SUMO2、Flag-SUMO3的細(xì)胞內(nèi)定位和表達(dá)的變化,以及使用鈣螯合劑和氯化鉀后的變化,來探討SUMO化修飾在活動依賴刺激中的作用機(jī)制。本研究設(shè)計基于以下幾點(diǎn)重要的研究發(fā)現(xiàn):1、SUMO化修飾參與神經(jīng)系統(tǒng)的一些重要過程,如神經(jīng)發(fā)育和突觸遞質(zhì)的釋放。2、氯化鉀引起的細(xì)胞膜去極化刺激作為活動依賴刺激能夠引起神經(jīng)元鈣內(nèi)流增加。3、鈣內(nèi)流的增加能夠引起細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活,其中鈣離子和受Ca2+/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的鈣調(diào)神經(jīng)

4、磷酸酶(calcineurin,CaN),均是介導(dǎo)鈣內(nèi)流效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,且在以往的文獻(xiàn)中均被認(rèn)為參與了神經(jīng)系統(tǒng)的活動依賴過程。
　　 方法：
　　 運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)構(gòu)建三株分別表達(dá)Flag-SUMO1,Flag-SUMO2和Flag-SUMO3的SHSY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系；以氯化鉀引起的細(xì)胞膜去極化刺激做為活動依賴刺激處理上述三株細(xì)胞不同的時間后,運(yùn)用免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)分別檢測Flag-SUMO1、Flag-S

5、UMO2和Flag-SUMO3的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位變化；再以鈣離子螯合劑乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)和 CaN特異性抑制劑環(huán)孢霉素(cyclosporin A,CsA)與氯化鉀同時處理上述三株細(xì)胞,免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測Flag-SUMO1、Flag-SUMO2和Flag-SUMO3的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1)成功構(gòu)建了三株分別表達(dá)Flag-SUM

6、O1、Flag-SUMO2和Flag-SUMO3的SHSY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　 2)活動依賴刺激上調(diào)SHSY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中SUMO化修飾:其中SUMO1和SUMO3的變化呈時間依賴性,而SUMO2呈雙相變化。
　　 3)活動依賴刺激處理三株SHSY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系60min后,SUMO1和SUMO3的定位發(fā)生改變,而SUMO2的定位沒有明顯變化。
　　 4)鈣內(nèi)流介導(dǎo)了活動依賴調(diào)節(jié)的SUMO化修飾。
　　

7、 結(jié)論：
　　 活動依賴刺激上調(diào)SHSY5Y細(xì)胞整體SUMO化修飾,這一過程呈時間依賴關(guān)系,并被鈣內(nèi)流所介導(dǎo)。
　　 第二部分
　　 異丙酚上調(diào)整體SUMO化修飾對過氧化氫引起的SHSY5Y細(xì)胞死亡的保護(hù)作用
　　 研究背景:
　　 SUMO化修飾是近年來發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道,SUMO化修飾在過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)刺激下能夠激活,但是其在

8、該過程中的作用并不明確?；诖?我們首先研究在H2O2引起的細(xì)胞凋亡過程中SUMO化修飾發(fā)揮的作用。其次,根據(jù)臨床常用靜脈麻醉藥物異丙酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性抗氧化劑α-生育酚(維生素E)十分相似,因此也具有抗氧化作用的特點(diǎn),我們探討了SUMO化修飾是否參與了異丙酚在H2O2處理過程中的抗氧化作用。也即本部分研究的主要目的是探討SUMO化修飾在異丙酚抗氧化效應(yīng)中的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 分別表達(dá)Flag-SUMO1、

9、Flag-SUMO2和Flag-SUMO3的SHSY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,以H2O2(200 mM)處理6個小時后,用Annexin-Ⅴ方法檢測不同細(xì)胞的死亡率和生存率,從而探討不同的SUMO化修飾在H2O2處理引起細(xì)胞死亡過程中的作用。隨后,將SHSY5Y細(xì)胞在不同濃度異丙酚(50μM、100μM、200μM和500μM)預(yù)處理后,再給予H2O2(200mM)處理6個小時,以細(xì)胞增殖和毒性實(shí)驗(yàn)(CCK-8)來檢測異丙酚的保護(hù)作用。同時用免疫

10、印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測該過程中細(xì)胞內(nèi)源性SUMO1、SUMO2/3的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1)過表達(dá)Flag-SUMO1、Flag-SUMO2的SHSY5Y細(xì)胞系在H2O2處理后與正常細(xì)胞相比死亡率明顯降低。而過表達(dá)Flag-SUMO3的SHSY5Y細(xì)胞在H2O2處理后與正常細(xì)胞相比,細(xì)胞死亡率沒有明顯變化。
　　 2)異丙酚預(yù)處理后,對H2O2處理引起的SHSY5Y細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用,在此過程中,SUMO1,S