胃組織紅桂木凝集素受體表達(dá)的研究.pdf

1、目的:
　　目前惡性腫瘤是疾病死亡的首位原因。細(xì)胞癌變、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移往往表現(xiàn)為細(xì)胞膜上糖蛋白或糖脂的改變，根據(jù)凝集素對(duì)糖及其綴合物高度專一識(shí)別的特性，可利用外源植物凝集素作為探針在分子水平上研究細(xì)胞惡變過(guò)程中膜結(jié)構(gòu)的改變。本課題首先將紅桂木凝集素進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素標(biāo)記，然后進(jìn)行凝集素組化染色，觀察胃癌組織和胃正常組織中紅桂木凝集素受體的表達(dá)差異，為探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及紅桂木凝集素在腫瘤診斷中的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)

2、依據(jù)。
　　方法:
　　一、分離純化紅桂木凝集素:參照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分離、純化紅桂木凝集素的方法[1,2]，將紅桂木種子研磨，硫酸鹽分級(jí)沉淀法鹽析蛋白，采用Gal-Sepharose6B親和層析純化蛋白，透析、超濾、凍干、儲(chǔ)存。紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)紅桂木凝集素活性。
　　二、ALL-FITC和ALL-HRP的制備
　　1.ALL-FITC的制備:
　　(1)透析法制備ALL-FITC:將紅桂木凝集素凍干粉配制成

3、溶液，測(cè)定濃度，加入FITC，將溶液充分混勻，透析，測(cè)定偶聯(lián)物F/P值。
　　(2)固化法制備ALL-FITC:先將紅桂木凝集素與Sepharose4B固相吸附，再將FITC溶液滴入凝膠柱內(nèi)，用Gal-PBS洗脫ALL-FITC，測(cè)定該偶聯(lián)物F/P值。
　　(3)比較兩種方法的F/P值。
　　2.ALL-HRP的制備:
　　ALL-HRP的制備:采用高碘酸鹽氧化法制備，將HRP在高碘酸鈉溶液中對(duì)乙酸緩沖液透析，再

4、加入已測(cè)定好濃度的紅桂木凝集素溶液，透析后避光保存。
　　三、胃組織中紅桂木凝集素受體的表達(dá)分析
　　1.病例收集:收集32例胃腺癌癌變組織切片和25例胃正常組織切片。
　　2.ALL-FITC染色:石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，將ALL-FITC覆蓋于組織上，避光孵育，復(fù)染DAPI，利用熒光倒置顯微鏡觀察紅桂木凝集素受體表達(dá)情況。
　　3.ALL-HRP染色:石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，將ALL-HRP覆蓋于組織上，避光孵育

5、，再用蘇木精復(fù)染，DAB試劑盒顯色，在顯微鏡下觀察紅桂木凝集素受體表達(dá)情況。
　　四、ALL-Sepharose6B的制備:
　　將活化好的Sepharose6B與ALL親和吸附，封閉Sepharose6B其余的活性基團(tuán)，測(cè)定ALL-Sepharose6B的凝血活性。
　　結(jié)果:
　　一、從紅桂木種子中分離純化得到紅桂木凝集素，經(jīng)紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，凝集活力為29-211。
　　二、透析法制備ALL-FIT

6、C的F/P值為0.758，固化法的F/P值為1.02，兩種方法所制備的ALL-FITC用于石蠟切片染色均得到較好的效果。
　　三、胃癌組織紅桂木凝集素受體的表達(dá)觀察
　　1.ALL-FITC染色:
　　正常胃組織經(jīng)染色后在熒光顯微鏡下可看到較微弱的綠色熒光，胃腺癌切片在鏡下可看見(jiàn)明亮的綠色熒光，藍(lán)色細(xì)胞核分布在綠色熒光中，說(shuō)明紅桂木凝集素受體主要分布在癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)。胃正常組織和胃腺癌組織均有紅桂木凝集素受體表達(dá)，胃腺

7、癌組織陽(yáng)性率為68.8％，胃正常組織陽(yáng)性率為24％，兩組受體表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，表明胃腺癌組織紅桂木凝集素受體表達(dá)明顯多于正常胃組織的。
　　2.ALL-HRP染色:
　　鏡下觀察胃正常組織輕微著染，胃腺癌組織則著染為棕褐色，受體主要分布在癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)，有些受體主要分布在癌細(xì)胞的一側(cè)胞漿中，有的則散布在整個(gè)胞漿內(nèi)，細(xì)胞核未見(jiàn)著染。胃正常組織和胃腺癌組織均有紅桂木凝集素受體表達(dá)，胃腺癌組織陽(yáng)性率為75％，

8、胃正常組織陽(yáng)性率為16％，兩組受體表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000.)，表明胃腺癌組織紅桂木凝集素受體表達(dá)明顯多于正常胃組織的。
　　四、偶聯(lián)Sepharose6B的ALL可使紅細(xì)胞凝集，說(shuō)明Sepharose6B已成功偶聯(lián)ALL。
　　結(jié)論:
　　一、固化法制備ALL-FITC優(yōu)于透析法。
　　二、本實(shí)驗(yàn)制備的ALL-FITC和ALL-HRP均可用于組織細(xì)胞紅桂木凝集素受體的表達(dá)分析。
　　三、紅桂木