基于豬CCR1和CCR5受體高通量細(xì)胞篩選模型的構(gòu)建及其條件優(yōu)化.pdf

1、趨化因子受體1(chemokine receptor1，CCR1)和趨化因子受體5(chemokine receptor5，CCR5)屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族成員，可由單核細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌，在心臟、腦、呼吸道、生殖器官等均有表達(dá)。研究表明CCR1和CCR5與其配體作用在機(jī)體呼吸道系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和生長(zhǎng)發(fā)育中均發(fā)揮著重要作用。CCR1和CCR5的共用配體RANTES為CC型趨化因子，RANTES在病毒感

2、染時(shí)表現(xiàn)活躍，某些病原影響RANTES表達(dá)的機(jī)制也初步被闡明。但是在豬方面，關(guān)于RANTES與其受體CCR1和CCR5作用后，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激活情況如何以及是否能影響某些病毒病的感染過(guò)程尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　為了探究RANTES與豬CCR1和CCR5作用后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激活情況，尋找作用CCR1或CCR5的活性化合物，以及其是否能在豬傳染性疾病中起到作用，本研究通過(guò)對(duì)豬CCR1和豬CCR5進(jìn)行分子克隆并構(gòu)建了真核表達(dá)載體，在獲得pcDNA3.

3、1(+)-myc/CCR1和pcDNA3.1(+)-myc/CCR5后，分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因法，使用微孔板多功能熒光素酶檢測(cè)儀檢測(cè)RANTES作用后熒光素酶的表達(dá)量。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果選擇報(bào)告基因與CCR1或CCR5轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，使用G418和潮霉素B加壓篩選，通過(guò)有限稀釋法和單熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶熒光值的變化情況，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1單克

4、隆細(xì)胞。為了尋找CCR1和CCR5的活性化合物，對(duì)能影響高通量篩選過(guò)程中CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1熒光素酶表達(dá)量的各個(gè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。全文主要成果如下:
　　1、使用PCR技術(shù)從豬的肌肉組織中擴(kuò)增出1062bp的CCR1基因片段和1059bp的CCR5基因片段。將豬CCR1和CCR5基因連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)并獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-myc/CCR1和pcDNA3.

5、1(+)-myc/CCR5。
　　2、將pcDNA3.1(+)-myc/CCR1和pcDNA3.1(+)-myc/CCR5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，通過(guò)RT-PCR技術(shù)和Western blotting技術(shù)鑒定目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，結(jié)果顯示目的基因順利表達(dá)。
　　3、將pcDNA3.1(+)-myc/CCR1和pcDNA3.1(+)-myc/CCR5重組質(zhì)粒分別與pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]或p

6、GL4.33[luc2P/SRE/Hygro]和pGL4.74[hRluc/TK]共轉(zhuǎn)染到 HEK293T細(xì)胞中，預(yù)先加入Forskolin或不加刺激2h后，加入RANTES作用6h收集細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)量，根據(jù)熒光素酶表達(dá)量變化間接反映出配體作用后對(duì)細(xì)胞內(nèi)CRE元件和SRE元件的激活情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RANTES作用于CCR5對(duì)CRE和SRE均表現(xiàn)激活效應(yīng)，作用于CCR1對(duì)SRE激活，而對(duì)CRE表現(xiàn)出抑制效應(yīng);
　　4、分別轉(zhuǎn)

7、染pcDNA3.1(+)-myc/CCR1與pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]，pcDNA3.1(+)-myc/CCR5與pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro]重組質(zhì)粒到CHO-K1細(xì)胞中，通過(guò)G418和潮霉素B加壓篩選，有限稀釋法進(jìn)行單克隆和配體結(jié)合試驗(yàn)，獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞模型CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1;
　　5、對(duì)目的基因細(xì)胞模型高通量篩選條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果C