糞菌移植治療小鼠艱難梭菌感染的安全性評(píng)價(jià).pdf

1、目的：
　　艱難梭菌（Clostridium difficile，CD）是一種革蘭染色陽(yáng)性、專性厭氧的粗大芽孢桿菌，在生存環(huán)境惡劣的情況下可形成次級(jí)端芽孢，主要在人與人之間通過(guò)糞口途徑傳播并定植于腸道。正常成人艱難梭菌無(wú)癥狀攜帶率為5-15％，住院患者可達(dá)57％，嬰幼兒艱難梭菌攜帶率比成人高，可達(dá)84.4％。艱難梭菌是院內(nèi)獲得性腹瀉的主要病原菌，也是社區(qū)獲得性腹瀉的重要致病菌。
　　1978年，第一次發(fā)現(xiàn)了艱難梭菌與偽膜性腸

2、炎(Pseudomembranous colitis，PMC)相關(guān)。正常情況下，艱難梭菌可存在于腸道中，并不致病。當(dāng)長(zhǎng)期大量應(yīng)用廣譜抗生素等原因造成腸道穩(wěn)態(tài)失衡，艱難梭菌過(guò)度繁殖，引起艱難梭菌相關(guān)性感染（Closrtidium difficile infection，CDI）的發(fā)生，可導(dǎo)致艱難梭菌感染相關(guān)性腹瀉（Clostridium difficile associated diarrhea，CDAD）。CDI是15％～25％抗生素相

3、關(guān)性腹瀉(Antibiotic-associated diarrhea，AAD)的病因，也是幾乎所有抗生素相關(guān)性偽膜性結(jié)腸炎的病因。
　　臨床上大多數(shù)患者感染艱難梭菌后無(wú)癥狀，表現(xiàn)為健康攜帶者;出現(xiàn)臨床癥狀者可表現(xiàn)為輕至重度水樣瀉、暴發(fā)性腸炎、偽膜性腸炎甚至感染性休克等全身癥狀。腹瀉癥狀常出現(xiàn)于應(yīng)用抗生素的過(guò)程中或是停用抗生素短期內(nèi)，偶有停用數(shù)月后發(fā)病者。所有抗生素都可引起艱難梭菌感染，其中克林霉素、頭孢菌素類和喹諾酮類引起的感染

4、風(fēng)險(xiǎn)更高，而哌拉西林/他唑巴坦、替加環(huán)素等則很少引發(fā)CDI。目前CDI的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是使用甲硝唑或萬(wàn)古霉素，但高達(dá)25％的患者在使用這2種抗生素后30天內(nèi)可出現(xiàn)復(fù)發(fā)，初次復(fù)發(fā)后再次復(fù)發(fā)率則可升高至40-65％。復(fù)發(fā)性CDI不僅難以治療，而且會(huì)影響患者數(shù)月甚至數(shù)年，降低其生活質(zhì)量，增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　由于廣譜抗生素的濫用、高毒力菌株的出現(xiàn)、菌株耐藥率增加等因素，CDI的發(fā)病率逐年升高，特別是在近期有住院史或是長(zhǎng)期居住在照護(hù)機(jī)構(gòu)的老年

5、人群中。歐美國(guó)家曾多次發(fā)生爆發(fā)流行，流行期間病死率明顯升高，導(dǎo)致醫(yī)療保健費(fèi)用隨之增加。為了更好地進(jìn)行艱難梭菌感染發(fā)病機(jī)制的研究、疫苗的制備、新治療方案的評(píng)價(jià)等，須建立穩(wěn)定可靠的CDAD動(dòng)物模型。
　　倉(cāng)鼠、豚鼠、無(wú)菌鼠、大鼠和小鼠都曾作為CDAD的模型動(dòng)物。過(guò)去應(yīng)用最廣的是倉(cāng)鼠模型，但由于倉(cāng)鼠感染艱難梭菌后腹瀉癥狀重，是一種暴發(fā)性、致死性的疾病過(guò)程。這與國(guó)內(nèi)臨床上人體感染艱難梭菌的常見結(jié)局不同，無(wú)法完全代表人類的感染過(guò)程。由于發(fā)現(xiàn)

6、誘導(dǎo)小鼠易感性增加的新方法以及可應(yīng)用于小鼠宿主組織分析的特異性試劑的改進(jìn)等原因，近幾年小鼠CDI模型的應(yīng)用增加。Chen等發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)混合抗生素+克林霉素誘導(dǎo)后，C57BL/6小鼠可成功感染艱難梭菌并出現(xiàn)腹瀉，感染過(guò)程與人類相似，從而成為目前CDAD主要的模型動(dòng)物。但我們前期研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用本課題組臨床分離菌株進(jìn)行建模，C57BL/6模型鼠感染嚴(yán)重程度難控制，多數(shù)小鼠腹瀉程度較輕，呈自愈性，可能限制其在難治性及復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染研究中的應(yīng)用。故

7、本研究選擇國(guó)內(nèi)科研常用的3種品系小鼠，擬構(gòu)建不同品系小鼠CDAD動(dòng)物模型，并通過(guò)臨床和病理指標(biāo)對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)估，篩選出最具臨床代表性且穩(wěn)定的動(dòng)物模型，為艱難梭菌感染相關(guān)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)工具。
　　糞菌移植(Fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是指將健康人糞便中的功能菌群，移植到患者胃腸道內(nèi)，重建具有正常功能的腸道菌群，從而達(dá)到治療腸道及腸道外疾病的目的。近十年來(lái)，因?yàn)樵谥委熎D難梭菌感染方面

8、療效突出，糞菌移植受到國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的關(guān)注。目前全世界已報(bào)道數(shù)千例應(yīng)用糞菌移植的病例，這些病例中包括胃腸道疾病（如艱難梭菌感染、炎癥性腸病、腸易激綜合征等）和非胃腸道疾?。ㄈ缙诰C合征、特發(fā)性血小板減少性紫癜等）。
　　糞菌移植治療難治性艱難梭菌感染有效率可達(dá)80％-90％，并且相較于應(yīng)用萬(wàn)古霉素等治療方案，F(xiàn)MT療程短、花費(fèi)少、效果明顯。2013年2月，美國(guó)食品及藥品監(jiān)督管理局將FMT寫入CDI治療指南中:建議在間歇性萬(wàn)古霉素治

9、療后第三次復(fù)發(fā)時(shí)，即可考慮使用FMT。
　　雖然目前FMT已經(jīng)用于多種疾病的臨床治療，但是FMT作為一項(xiàng)尚不完全成熟的臨床治療手段，其長(zhǎng)期安全性問(wèn)題，還缺乏足夠的臨床和實(shí)驗(yàn)室資料。最主要的不良反應(yīng)包括噯氣、腹脹、腹部絞痛等消化道癥狀;而部分患者在FMT后可出現(xiàn)低熱、腹瀉增加等小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)的癥狀，該癥狀多在FMT后3天內(nèi)消失。此外，F(xiàn)MT更大的風(fēng)險(xiǎn)可能是基于腸道菌群的改變，誘發(fā)慢性病的發(fā)生。目前已知腸道菌群與一些疾病的發(fā)生相關(guān)，

10、包括肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥性腸病、結(jié)腸癌、非酒精性脂肪肝、腸易激綜合征、哮喘和自閉癥等。改變宿主原有的腸道菌群結(jié)構(gòu)，可能增加發(fā)生這些疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
　　目前還沒(méi)有足夠研究來(lái)證實(shí)FMT的安全性，本研究擬通過(guò)小鼠CDAD模型驗(yàn)證FMT治療艱難梭菌感染的有效性，同時(shí)初步探索FMT對(duì)宿主行為活動(dòng)、代謝、免疫等方面的影響，為評(píng)價(jià)FMT的安全性提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.構(gòu)建艱難梭菌感染小鼠穩(wěn)定模型，挑選理想的模型動(dòng)物

11、
　　選擇南方醫(yī)院臨床分離菌株共50株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，通過(guò)觀察菌落形態(tài)、鏡下形態(tài)、乳酸脫氫酶檢測(cè)、生化鑒定及毒素檢測(cè)等方法鑒定。根據(jù)核糖分型，選擇其中最為常見的作為本研究實(shí)驗(yàn)菌株。
　　選擇C57BL/6、BALB/c、昆明小鼠，3種品系小鼠各24只，按隨機(jī)分組原則分為4組（對(duì)照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組），每組6只。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)抗生素誘導(dǎo)后，分別予以不同濃度(108CFU/ml～1010CFU/ml)的臨床分離菌株混懸液灌

12、胃，觀察不同品系小鼠不同時(shí)間點(diǎn)腹瀉、全身情況及結(jié)腸組織病理學(xué)變化。
　　2.BALB/c小鼠腹瀉癥狀呈細(xì)菌濃度依賴性
　　低濃度組(108CFU/mL)中C57BL/6小鼠(n=6)未出現(xiàn)腹瀉;BALB/c小鼠3只出現(xiàn)重度腹瀉癥狀;KM小鼠1只出現(xiàn)輕度腹瀉癥狀。
　　中濃度組(109CFU/mL)中C57BL/6小鼠1只輕度腹瀉;BALB/c小鼠5只出現(xiàn)重度腹瀉癥狀，濕尾范圍較其低濃度組稍大;KM小鼠4只出現(xiàn)不同程度腹

13、瀉，其中1只死亡，至觀察終點(diǎn)存活率為83.3％。
　　高濃度組(1010CFU/mL)中C57BL/6小鼠3只出現(xiàn)重度腹瀉;BALB/c小鼠6只均出現(xiàn)腹瀉，1只小鼠死亡，至觀察終點(diǎn)存活率為83.3％; KM小鼠4只出現(xiàn)腹瀉癥狀，未發(fā)現(xiàn)死亡。
　　感染后小鼠平均體重下降明顯，同時(shí)觀察到小鼠活動(dòng)度下降，毛發(fā)脫落，嚴(yán)重者出現(xiàn)弓背。
　　3.腹瀉小鼠糞便中分離出艱難梭菌
　　隨機(jī)選取3種腹瀉小鼠糞便涂片、染色，可見不同程

14、度腸道菌群失調(diào)及革蘭陽(yáng)性粗大芽孢桿菌。將腹瀉小鼠糞便或腸內(nèi)容物接種至CCFA-HT培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)并分純，可見艱難梭菌典型菌落形態(tài)。核型分析證實(shí)小鼠糞便分離菌株核型與實(shí)驗(yàn)菌株一致。
　　4.結(jié)腸病理評(píng)分與癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)
　　健康對(duì)照組0分，低濃度組中C57BL/6小鼠為0.3±0.5、BABL/c小鼠為1.5±0.5、KM小鼠為0.7±0.5，中濃度組中C57BL/6小鼠為0.7±0.5、 BABL/c小鼠為2.0±0.9、

15、KM小鼠為1.8±1.7，高濃度組中C57BL/6小鼠為1.0±0.6、BABL/c小鼠為3.2±1.2、KM小鼠為1.8±1.0。
　　5.糞菌移植治療小鼠艱難梭菌感染
　　BALB/c小鼠共60只，按隨機(jī)分組原則分為4組，每組15只。根據(jù)不同處理分為空白對(duì)照組、灌菌組、單次FMT組、3次FMT組，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（FMT后1天、FMT后1周、FMT后1月）每組分別處死5只。建模前及每次處死前進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：<

16、br>　　1.FMT治療組腹瀉小鼠減少，未出現(xiàn)死亡.
　　2.FMT能減輕小鼠腸道炎癥.
　　結(jié)論:
　　1.以BALB/c小鼠為對(duì)象，予慶大霉素、甲硝唑、多粘菌素、萬(wàn)古霉素、卡那霉素混合抗生素溶液連續(xù)灌胃9天+克林霉素腹腔注射做預(yù)處理，24h后予1010CFU/ml細(xì)菌混懸液灌胃即可成功建立穩(wěn)定的具有臨床代表性的小鼠CDAD模型;
　　2.治療小鼠艱難梭菌感染時(shí)，增加糞菌移植次數(shù)未能明顯增加療效;
　　3