產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白在感染小鼠器官分布的檢測.pdf

1、為了認識α毒素在感染產(chǎn)氣莢膜梭菌動物體內(nèi)的分布，深入探討產(chǎn)氣莢膜梭菌的腸源毒血癥的致病機理，本實驗自制了高效價的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的多克隆抗體，并以此作為一抗采用免疫組織化學(xué)方法對人工感染產(chǎn)氣莢膜梭菌病的小鼠體內(nèi)的α毒素進行了定位，闡明了產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的分布狀況，揭示了家畜猝死癥的致病機理。
　　 本研究首先在厭氧條件下培養(yǎng)復(fù)活了A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，提取DNA模板，設(shè)計特異性的引物，并對其α毒素的全長基因進行PCR擴增、

2、克隆。以常規(guī)基因重組技術(shù),將回收的目的基因片段插入原核表達載pET28a，得到重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序鑒定后，用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化完成后，用IPTG誘導(dǎo)表達，摸索誘導(dǎo)最優(yōu)條件后，將最佳條件下的誘導(dǎo)產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳，并經(jīng)鎳柱親和純化目的蛋白；PBS透析，Western blot檢測了蛋白的特異性。將表達并純化的α毒素蛋白500μg混以免疫弗氏佐劑免疫家兔四次，定期取血清并用ELISA方法檢測抗體滴度，

3、獲得多克隆抗體。將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種產(chǎn)毒培養(yǎng)基，厭氧環(huán)境45C、4h培養(yǎng)，取培養(yǎng)液常規(guī)硫酸銨法提取外毒素，用滅菌生理鹽水稀釋，腹腔皮下注射小鼠，取72h內(nèi)死亡小鼠的器官組織：心、肝、脾、肺、腎、胃，小腸、延腦，投入4％多聚甲醛中固，然后制作組織切片，用自制的兔抗α毒素多克隆抗體作為一抗，ＨＲＰ（辣根過氧化物酶）和ＦＩＴＣ（熒光素）分別標(biāo)記的羊抗兔IgG，作為二抗。通過免疫組織化學(xué)法對患產(chǎn)氣莢膜梭菌病的小鼠體內(nèi)的α毒素進行了定位檢測。

4、>　　 研究表明，PCR擴增出長度為1228 bp的產(chǎn)物，通過Blast比對，確認為α毒素基因；對表達載體pet28a和含有目的基因的重組T載體分別進行雙酶切，并將酶切后的線性pet28回收產(chǎn)物和酶切后的目的片段回收產(chǎn)物進行連接，成功構(gòu)建了pet28a-α表達載體。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，獲得大小為45KD特異的表達條帶，表達量可達42.1％。Western blot結(jié)果證明表達的目的蛋白具有高度的特異性。以表

5、達的α毒素蛋白為抗原，四次免疫家兔后，獲得得多克隆抗體經(jīng)ELISA測定，其效價為1 ：512,000。經(jīng)免疫組織化學(xué)法對器官的毒素分布檢測指出，在小鼠的延髓、腸、腎、肺、胃的組織細胞胞漿中發(fā)現(xiàn)了陽性顆粒，說明α毒素隨血液循環(huán)系統(tǒng)進入并侵害了動物的延髓、腸、腎、肺、胃等組織。在脾、肝的血管內(nèi)發(fā)現(xiàn)陽性顆粒，但在主質(zhì)細胞中未發(fā)現(xiàn)毒素分布，說明毒素?zé)o法侵害脾肝的主質(zhì)細胞。研究顯示，本實驗成功的制備了高效價的兔抗α毒素多克隆抗體，免疫組化結(jié)果提示