產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素突變基因重組乳酸桿菌的構(gòu)建及其免疫學(xué)評價(jià).pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是廣泛存在自然界的一種常見的條件性致病菌，能夠引起動(dòng)物產(chǎn)生壞死性腸炎、腸毒血癥等，同時(shí)也是導(dǎo)致人類食物中毒和創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一。按毒素型分類，可將其分為A、B、C、D、E五個(gè)型，目前，已發(fā)現(xiàn)的外毒素至少有13種，其中α、β、ε和ι是主要的外毒素。ε毒素由B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生，是D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要毒素，同時(shí)也是一種孔毒素，對MDCK(犬腎細(xì)胞)具有致死作

2、用。
　　 為研究突變的產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素(mε)的抗體是否具有中和作用，本研究以毒素D型產(chǎn)氣莢膜梭菌全基因組DNA為模板，應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)(SOE-PCR)將ε毒素第106位的組氨酸殘基定點(diǎn)突變成脯氨酸殘基，擴(kuò)增出mε基因，使其喪失生物學(xué)毒性而保持其免疫原性。以pET-28a作為表達(dá)載體，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-mε，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組mε毒素蛋白，SDS-PAGE及western blot分析顯

3、示，表達(dá)的重組蛋白大小約39 ku，主要以包涵體形式存在。將重組蛋白免疫家兔，所制備的產(chǎn)氣莢膜梭菌mε毒素蛋白的抗血清經(jīng)10倍稀釋后，與2倍最小致死量(MLD)的產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清等體積混合時(shí)，能夠有效中和ε毒素。這些結(jié)果表明，重組突變的ε毒素具有較強(qiáng)的抗原性，這為產(chǎn)氣莢膜梭菌候選亞單位疫苗的研究及其血清學(xué)診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)乳酸桿菌密碼子使用的偏愛性，對ε毒素突變基因進(jìn)行了優(yōu)化并合成。以pPG-2作為其表達(dá)

4、載體，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pPG-2-mε，并電轉(zhuǎn)化至戊糖乳桿菌L.pentosus及干酪乳桿菌L.casei中，成功構(gòu)建重組戊糖乳桿菌pPG-2-mε/L.pentosus及重組干酪乳桿菌pPG-2-mε/L。pentosus。將構(gòu)建的兩種重組乳酸桿菌通過1％乳糖誘導(dǎo)進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，均有大小約39ku的融合蛋白表達(dá)，所表達(dá)蛋白的大小與理論值相符。Western blot鑒定結(jié)果表明，這兩種重組菌表達(dá)的蛋白均

5、可被產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素兔抗血清所識別，證實(shí)了ε毒素在兩種乳酸桿菌中確實(shí)得到了表達(dá)。
　　 為探討表達(dá)產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素蛋白的重組戊糖乳桿菌系統(tǒng)及重組干酪乳桿菌系統(tǒng)作為活菌疫苗潛在的應(yīng)用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)以BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行口服免疫實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組Ⅰ口服重組戊糖乳桿菌，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ口服干酪乳桿菌，實(shí)驗(yàn)組Ⅲ口服PBS作為對照。共免疫三次，每隔2w免疫一次，每次連續(xù)免疫3d。免疫后分別測定各組小鼠在第4、5、6、8、10、12、18

6、、19、20、22、24、26、32、33、34、36、38、40d時(shí)的糞便、鼻腔沖洗液及陰道沖洗液中抗ε毒素的特異性sIgA水平以及血清中抗ε毒素的特異性IgG水平。ELISA檢測結(jié)果表明，經(jīng)口服免疫重組戊糖乳桿菌及重組干酪乳桿菌的小鼠，在其糞便、鼻腔沖洗液及陰道沖洗液中均檢測到了特異性sIgA抗體，并在其血清中也檢測到了較高水平的特異性IgG抗體。這表明重組戊糖乳桿菌系統(tǒng)及重組干酪乳桿菌能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生局部黏膜免疫應(yīng)答和體液免疫