A型產(chǎn)氣莢膜梭菌減毒株的構(gòu)建及肉毒毒素A、B重鏈片段嵌合表達(dá)的研究.pdf

1、肉毒毒素是由肉毒梭菌產(chǎn)生的一類神經(jīng)毒素，能夠在人和動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)肉毒中毒，抑制神經(jīng)傳遞素的釋放，造成機(jī)體癱瘓，致死率極高，屬于典型的生物戰(zhàn)劑，一直以來在國(guó)際范圍內(nèi)普遍受到各國(guó)關(guān)注。在其所有致病方式中，食源性的肉毒中毒是臨床上最常見的。盡管，在對(duì)BoNT的檢測(cè)和控制方面已經(jīng)取得了一些成績(jī)，但是，始終沒有研發(fā)出免疫效果令人滿意的肉毒疫苗。近年來，關(guān)于活細(xì)菌口服疫苗的已經(jīng)報(bào)道越來越多，其優(yōu)勢(shì)日趨明顯，但是該策略在BoNTs疫苗方便的應(yīng)用幾乎很少

2、。本研究針對(duì)這一問題，利用基因工程手段使與肉毒梭狀桿菌同屬的產(chǎn)氣莢膜梭菌的plc毒力基因失活，構(gòu)建了具有較好安全性和穩(wěn)定性的產(chǎn)氣莢膜梭菌減毒株；然后將該減毒株作為BoNT/ABHc嵌合表達(dá)蛋白的口服細(xì)菌輸送載體，經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡分析，該嵌合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。本研究為探索和研究新的肉毒疫苗具提供了重要依據(jù)，取得主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 第一，我們用FTG培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株進(jìn)行復(fù)蘇，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，建立了針對(duì)產(chǎn)

3、氣莢膜梭菌各個(gè)主要毒力基因的多重PCR檢測(cè)方法，對(duì)現(xiàn)有產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要毒素基因進(jìn)行了檢測(cè)和分析。然后，結(jié)合其生長(zhǎng)特征，為構(gòu)建產(chǎn)氣莢膜梭菌減毒株挑選出一株不產(chǎn)生CPE、β、ε和ι毒素的野生型產(chǎn)氣莢膜梭菌作為后期實(shí)驗(yàn)菌株。
　　 第二，對(duì)上述實(shí)驗(yàn)菌株的plc基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在GeneBank中進(jìn)行B1ast比較分析，從中選取較為保守的596 bp片段，設(shè)計(jì)plc基因阻斷位點(diǎn)。針對(duì)plc基因阻斷位點(diǎn)，構(gòu)建grou

4、pⅡintron供體質(zhì)粒pJIR750ai-CG，使groupⅡintron特異性阻斷plc基因的表達(dá)。經(jīng)觀察卵磷脂反應(yīng)和溶血反應(yīng)，以及蛋白質(zhì)免疫印跡分析，證明plc基因減毒株喪失表達(dá)α毒素蛋白的能力。通過連續(xù)傳代培養(yǎng)，使plc減毒株丟失groupⅡintron供體質(zhì)粒，繼續(xù)傳代培養(yǎng)15～20代，轉(zhuǎn)接到產(chǎn)芽孢的DS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)芽孢染色、鏡檢，證明plc減毒株形成芽孢的能力較好，與野生型無差異，且沒有恢復(fù)plc毒力的趨勢(shì)。
　　

5、 第三，設(shè)計(jì)并合成了A型肉毒毒素重鏈和B型肉毒毒素重鏈各50 kDa的嵌合體BoNT/ABHc，將其連接到一個(gè)具有cpe ORF的穿梭型質(zhì)粒pJRC200上。經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化、菌落PCR篩選，最終獲得能夠表達(dá)BoNT/ABHc的產(chǎn)氣莢膜梭菌plc減毒株。蛋白質(zhì)免疫印跡分析結(jié)果表明，成功構(gòu)建和表達(dá)了嵌合體BoNT/ABHc，該嵌合體具有良好的反應(yīng)原性。
　　 基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們?yōu)檠邪l(fā)以產(chǎn)氣莢膜梭菌減毒株作為抗原輸送載體的口服疫苗