田鼠巴貝蟲(chóng)病分子調(diào)查及其診斷抗原高通量篩選.pdf

1、目的：
　　對(duì)中緬邊境地區(qū)發(fā)熱人群田鼠巴貝蟲(chóng)（Babesia microti）感染情況調(diào)查及田鼠巴貝蟲(chóng)病相關(guān)診斷抗原候選分子高通量篩選鑒定。
　　方法：
　　1）首先對(duì)2014年6～8月期間在中緬邊境地區(qū)收集的200份排除瘧疾感染發(fā)熱病人的全血血樣提取DNA，然后應(yīng)用基于田鼠巴貝蟲(chóng)18srRNA序列與微管蛋白序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析鑒定田鼠巴貝蟲(chóng)感染情況。
　　2）基于田鼠巴貝蟲(chóng)公共數(shù)據(jù)庫(kù)篩選分泌

2、蛋白、重復(fù)序列和PiroplasmaDB公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中部分田鼠巴貝蟲(chóng)與惡性瘧原蟲(chóng)、牛巴貝蟲(chóng)同源序列篩選構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，從田鼠巴貝蟲(chóng)（Babesia microti ATCC PRA-99TM）感染的BALB/c小鼠血液中提取田鼠巴貝蟲(chóng)RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以田鼠巴貝蟲(chóng)cDNA為模板擴(kuò)增目的基因片段。利用無(wú)縫克隆技術(shù)連接目的基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pEU-His，經(jīng)過(guò)重組質(zhì)粒的鑒定，最后獲得含有目的基因片段的表達(dá)質(zhì)粒。利用試劑盒提取

3、重組質(zhì)粒后，采用麥胚無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá)，用western-blot技術(shù)分析鑒定出表達(dá)正確的蛋白。通過(guò)蛋白芯片技術(shù)用不同感染時(shí)期鼠血清對(duì)表達(dá)正確的蛋白進(jìn)行高通量篩選。
　　結(jié)果：
　　1）在200份發(fā)熱病人巢式PCR檢測(cè)有2份病人全血經(jīng)兩種巢式PCR和測(cè)序分析鑒定為田鼠巴貝蟲(chóng)感染，并經(jīng)進(jìn)化序列分析為人獸共患型田鼠巴貝蟲(chóng)株。
　　2）篩選222個(gè)目的基因片段構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，PCR成功擴(kuò)增了215個(gè)片段，無(wú)縫克隆成功

4、構(gòu)建了186個(gè)重組質(zhì)粒，麥胚無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)成功表達(dá)了167個(gè)重組蛋白。以感染田鼠巴貝蟲(chóng)的BALB/c小鼠不同時(shí)期血清為抗體，利用蛋白芯片技術(shù)從167個(gè)重組抗原中篩選出10個(gè)重組抗原，分別是：BmSP44、BmRS8、BmRS21、BmRS28、BmRS29、BmHP3
　　3、BmHP37、BmHP41、BmHP42和BmHP43。
　　結(jié)論：
　　在我國(guó)云南省中緬邊境地區(qū)存在可感染人和其他哺乳動(dòng)物的田鼠巴貝蟲(chóng)；用