模擬微重力誘導成骨細胞微絲變化對成骨細胞標志產(chǎn)物(骨鈣蛋白、堿性磷酸酶)及NO-NOS系統(tǒng)的影響.pdf

1、背景：隨著載人航空事業(yè)的發(fā)展,太空失重導致的骨質(zhì)疏松越來越受到科學家的關注,空間飛行試驗積累的資料已經(jīng)總結出,失重性骨質(zhì)稀少的主要原因是骨形成的減少而不是骨吸收的增強。成骨細胞是骨形成、發(fā)育和生長過程中的重要細胞。以往的研究熱點主要集中在微重力對成骨細胞分化過程的影響,隨著細胞學研究的發(fā)展,對于失重性骨質(zhì)疏松的研究漸漸聚集在細胞分子水平的探索。對微重力條件下,成骨細胞感受和傳導機械應力的結構、細胞信號轉導及基因表達等發(fā)生的變化都取得了一

2、定的進展。
　　 大量研究發(fā)現(xiàn),微重力導致細胞分化成熟相關物質(zhì)(堿性磷酸酶,骨鈣素和Ⅰ型膠原)的mRNA表達及蛋白合成減少,還導致成骨細胞COX-2的基因表達下調(diào)及PGE2和NO分泌量增加。也有研究表明細胞骨架系統(tǒng)對微重力環(huán)境非常敏感,細胞骨架微管和微絲重排可能參與微重力導致的細胞形態(tài)及功能變化過程。
　　 近年來,NO在骨質(zhì)疏松發(fā)展過程中作為信息分子的生理作用也已被人們重視。已經(jīng)達成共識的是,成骨細胞的增殖及其骨基質(zhì)蛋

3、白分泌的功能依賴于少量NO的存在,而高濃度的NO既抑制成骨細胞的增殖和分化,還顯著抑制成骨細胞堿性磷酸酶的活性和抑制成骨細胞合成骨鈣素等骨基質(zhì)蛋白。而NO是由NOS(nitric oxide synthase,NOS)以L-精氨酸為底物合成的,NOS作為一種局部信號分子,不同亞型的NOS所生成的不同濃度的NO對成骨細胞具有完全不同的生理意義。已有研究表明,微重力可促使NO/NOS系統(tǒng)發(fā)生一系列改變,如NO濃度增多等。
　　 本實

4、驗在前人研究的基礎上,通過模擬微重力誘導微絲改變后,檢測出成骨細胞NO/NOS系統(tǒng)的改變及成骨細胞標志產(chǎn)物(堿性磷酸酶和骨鈣素)的變化,由此探討失重導致骨質(zhì)疏松的機制,是否是微重力誘導微絲改變影響NO/NOS信號系統(tǒng)進而導致基因表達發(fā)生改變而影響細胞的分化過程。
　　 目的：本研究主要從細胞水平探討失重導致骨丟失的機制。通過對成骨細胞骨架微絲的觀察及NO/NOS系統(tǒng)和成骨細胞標志產(chǎn)物的檢測,得出它們之間的關聯(lián)性,以期為失重性骨質(zhì)

5、疏松的機制研究提供新的線索。
　　 對象和方法：
　　 1.細胞株及其培養(yǎng)本實驗所用的小鼠成骨細胞株MC3T3一E1是由南方醫(yī)科大學解剖教研室提供。實驗時均采用同一批凍存細胞復蘇后的第三代細胞,以保證細胞性狀的穩(wěn)定性。細胞用含10％胎牛血清(FBS)和雙抗的低糖DMEM培養(yǎng),2天換液,4天傳代。
　　 2.成骨細胞株活性鑒定:采用茜素紅礦化結節(jié)染色法檢測體外礦化能力。
　　 3.建立模擬微重力成骨細胞模型

6、、分組干預:實驗分為正常重力組、模擬微重力組、模擬微重力+0.5μ g/ml細胞松弛素B組、0.5μ g/ml細胞松弛素B組。
　　 4.細胞染色:用FITC標記的phalloidin對細胞骨架微絲進行染色,用DAPI對細胞核進行染色。
　　 5.ALP活性測定:對硝基苯酚法測定各組細胞培養(yǎng)液中的ALP活性。
　　 6.OCN表達量測定:運用ELISA測定各組細胞培養(yǎng)液中OCN的表達量。
　　 7.NO含

7、量測定:用硝酸還原酶法檢測各組細胞培養(yǎng)液中NO的濃度。
　　 8.NOS活性測定:使用NOS分型試劑盒測定細胞裂解液中NOS的酶活性。
　　 結果：
　　 1.成骨細胞生長情況:MC3T3-E1細胞株經(jīng)復蘇培養(yǎng)后,在相差顯微鏡下呈三角形、菱形、多邊形等不規(guī)則形狀,透明度好。細胞有觸突,胞漿豐富并向外伸展,伸出幾個突起與臨近細胞伸出的突起相連,有聚集成團(集落)的現(xiàn)象。胞核大而清楚,呈圓形或卵圓形,含1～2個核仁。

8、
　　 2.體外礦化能力檢測:末次傳代的細胞生長至2周后細胞呈復層狀生長,中心部細胞密集可發(fā)生鈣化,形成肉眼可見的散在白色點狀物。茜素紅法礦化結節(jié)染色后,鈣鹽沉積區(qū)域呈紅色。
　　 3.細胞微絲骨架的改變:采用微絲熒光標記技術同時檢測4組細胞微絲骨架結構的變化。細胞在旋轉培養(yǎng)及松弛素B處理后均出現(xiàn)微絲結構改變,結果表明細胞骨架對微重力及松弛素都非常敏感。MC3T3-E1細胞在經(jīng)過回轉模擬微重力培養(yǎng)后,細胞微絲骨架出現(xiàn)局部

9、解聚和張力纖維減少的趨勢,張力纖維短而纖細,散亂分布于胞漿內(nèi)、無方向性；0.5μg/ml細胞松弛素B處理的對照組微絲解聚的程度和模擬微重力組差不多,微絲結構也粗細不一、方向多變；模擬微重力+0.5μg/ml細胞松弛素B培養(yǎng)組的改變則更明顯,微絲明顯解聚、骨架蛋白彌散分布、細胞骨架的網(wǎng)絡結構消失、細胞核區(qū)不可分辨；而正常重力培養(yǎng)的對照組,細胞的微絲骨架排列有序、粗細均勻、走向清晰。
　　 4.各組ALP活性:MC3T3-E1細胞在

10、正常重力組中分泌的ALP的活性最高,為6.2867±0.3980金氏單位/1000ml,和其余3組的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模擬微重力+0.5μg/ml細胞松弛素B組的ALP活性為2.9333±0.7805金氏單位/100ml,較模擬微重力組稍低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而模擬微重力組和0.5μg/ml細胞松弛素B組的ALP活性分別為4.8900±0.6802金氏單位/100ml和5.6933+0.1266金氏單位

11、/100ml,兩組相比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 5.各組OCN表達量ELISA結果:模擬微重力組MC3T3-E1細胞表達的OCN的量為2.70816±0.53271pg/ml,居于正常重力組和模擬微重力+0.5μg/ml細胞松弛素B組之間,3組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。正常重力組細胞OCN的表達量最高,為14.23681±2.85252pg/ml,模擬微重力+0.5μ g/ml細胞松弛素B組最低,為

12、1.50685±0.40666 pg/ml。0.5μ g/ml細胞松弛素B組OCN的表達量為3.84456±1.23788pg/ml,和模擬微重力組相比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05),這和堿性磷酸酶的結果相統(tǒng)一。
　　 6.各組iNOS酶活性:模擬微重力組iNOS的酶活性為16.6043±1.3292U/ml,高于正常重力組,其值為5.8183±0.3196 U/ml,而低于模擬微重力+0.5μg/ml細胞松弛素B組,為19.6

13、990±0.5582 U/ml,且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。0.5μ g/ml細胞松弛素B組iNOS的酶活性為15.3760±2.8211U/ml,和模擬微重力組相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 7.各組eNOS酶活性:正常重力組eNOS的酶活性最高,為7.1510±0.6780 U/ml,和其余3組的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模擬微重力+0.5μ g/ml細胞松弛素B組eNOS的酶活性為1.0

14、987±0.4776 U/ml,較模擬微重力組稍低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而模擬微重力組和0.5μ g/ml細胞松弛素B組eNOS的酶活性分別為2.3613±0.2946 U/ml和2.4633±0.4603 U/ml,兩組相比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 8.各組NO濃度:實驗組及對照組MC3T3-E1細胞的培養(yǎng)液中均能檢測到NO的表達。模擬微重力組NO的濃度為109.2593±4.8996μ mol/L

15、,明顯高于正常重力組81.4813±2.4494μ mol/L,但低于模擬微重力+0.5μ g/ml細胞松弛素B組129.9383±9.9865μ mol/L,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.5)。而0.5μ g/ml細胞松弛素B組NO的濃度為100.0003μ8.0721μ mol/L,和模擬微重力組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結論：
　　 1.MC3T3-E1成骨細胞株具有和原代培養(yǎng)大鼠成骨細胞相同的生物學