海月水母響應(yīng)環(huán)境低氧的分子機(jī)制研究.pdf

1、河口、海灣及近岸海域出現(xiàn)的低氧區(qū)和海洋中大型膠質(zhì)類水母的暴發(fā)嚴(yán)重威脅到漁業(yè)資源和海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康。相對(duì)于其他海洋生物,水母類能夠耐受低氧并且頻繁出現(xiàn)在低氧水域,但是對(duì)此現(xiàn)象的機(jī)制性研究并不多見,尤其未見有關(guān)水母耐受低氧分子調(diào)控機(jī)制研究的報(bào)道。顯然,要了解環(huán)境低氧與水母暴發(fā)的相互關(guān)系,就必須對(duì)水母類響應(yīng)環(huán)境低氧的機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　針對(duì)水母類耐受低氧并且頻繁出現(xiàn)在低氧水域的現(xiàn)象,本文以我國(guó)近海大型水母—海月水母為研究對(duì)象,通過

2、構(gòu)建低氧培養(yǎng)控制體系,以低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia Inducible Factor, HIF)為中心,對(duì)低氧環(huán)境下海月水母生理活性、有關(guān)基因表達(dá)和代謝產(chǎn)物的含量進(jìn)行測(cè)定、比較和分析,以期揭示水母響應(yīng)低氧的分子機(jī)制。研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　1、證實(shí)了海月水母細(xì)胞內(nèi)存在低氧誘導(dǎo)因子基因
　　根據(jù)海月水母轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)部分基因序列,通過RT-PCR和RACE技術(shù)獲得HIF-1α基因2,466

3、 bp的全長(zhǎng)cDNA,共編碼675個(gè)氨基酸。對(duì)蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析表明,海月水母HIF-1α含有bHLH、PAS、NODD、CODD和CTAD五個(gè)保守的功能結(jié)構(gòu)域。以HIF-1α全長(zhǎng)cDNA序列為基礎(chǔ),通過克隆、測(cè)序、拼接得到10,739 bp的基因序列。通過與其他模式生物HIF-1α蛋白功能結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)的比較發(fā)現(xiàn),海月水母HIF-1α具有與高等動(dòng)物類似的完整的氧依賴降解調(diào)控結(jié)構(gòu)域(NODD、CODD和 CTAD),然而結(jié)構(gòu)域的組織

4、形式和基因結(jié)構(gòu)卻更傾向于低等動(dòng)物。
　　2、在海月水母體內(nèi)檢測(cè)到HIF-1α蛋白的存在并證實(shí)該蛋白受環(huán)境低氧的誘導(dǎo)表達(dá)
　　利用重組蛋白的體外表達(dá)技術(shù)成功獲得約為75 kDa的海月水母HIF-1α蛋白片段(融合蛋白),并通過免疫得到針對(duì)該蛋白片段的高效價(jià)特異性多克隆抗體。利用純化的多克隆抗體,通過免疫印跡技術(shù)在海月水母體內(nèi)檢測(cè)到HIF-1α蛋白的存在并證實(shí)該蛋白受環(huán)境低氧的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　3、確定了用于低氧相關(guān)基因表達(dá)

5、分析的內(nèi)參基因
　　通過對(duì)刺胞動(dòng)物門肌動(dòng)蛋白(actin)保守序列的分析,設(shè)計(jì)并合成其 actin基因的簡(jiǎn)并引物。以海月水母cDNA為模板,通過克隆測(cè)序獲得849 bp的β-actin基因的部分 cDNA序列。利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)對(duì)海月水母18S rRNA、β-actin、α-tubulin和GAPDH四個(gè)候選基因在正常(對(duì)照組)和低氧條件下的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),通過內(nèi)參基因篩選軟件對(duì)它們進(jìn)行分析篩選,最終確定α-tubuli

6、n基因作為海月水母耐受低氧分子機(jī)制研究的內(nèi)參基因。以此為基礎(chǔ),建立了低氧耐受過程相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量分析的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法(RFQ-PCR)。
　　4、研究了海月水母在低氧環(huán)境條件下的生理活性(傘部搏動(dòng))、脯氨酸羥基化酶-低氧誘導(dǎo)因子氧感受體系相關(guān)基因(PHD和 HIF-1α)、能量代謝相關(guān)基因(ALDO、LDH和PDK)和HSP70基因的表達(dá)以及能量代謝產(chǎn)物(乳酸)含量隨時(shí)間的變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn):
　　(1)在0.5

7、mg/L的低氧條件下,海月水母明顯受到環(huán)境低氧的脅迫,進(jìn)而表現(xiàn)出明顯的低氧適應(yīng)性,適應(yīng)周期大約為30小時(shí)。由于培養(yǎng)體系中氧氣的缺乏,海月水母的生理活性受到抑制,表現(xiàn)為海月水母?jìng)悴坎珓?dòng)的降低和 HSP70基因相對(duì)表達(dá)量的急劇增加,但經(jīng)過大約30個(gè)小時(shí)的機(jī)制轉(zhuǎn)換和調(diào)節(jié),會(huì)逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài)。(2)在海月水母適應(yīng)低氧的過程中,脯氨酸羥基化酶-低氧誘導(dǎo)因子氧感受體系相關(guān)基因和物質(zhì)能量代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量都在18小時(shí)出現(xiàn)峰值,說明此時(shí)海月水母

8、在分子水平上響應(yīng)低氧誘導(dǎo)和進(jìn)行能量代謝機(jī)制的轉(zhuǎn)換與調(diào)節(jié)最為活躍。(3)脯氨酸羥基化酶-低氧誘導(dǎo)因子氧感受體系在海月水母耐受并響應(yīng)環(huán)境低氧的過程中起重要作用。對(duì)照組中HIF-1α和PHD基因的相對(duì)表達(dá)量較為穩(wěn)定,而在低氧組中兩者均呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì),說明在分子水平上,海月水母細(xì)胞通過快速上調(diào) HIF-1α基因的轉(zhuǎn)錄而快速合成 HIF-1α蛋白,該蛋白迅速結(jié)合到PHD基因的增強(qiáng)子區(qū)域,誘導(dǎo)PHD基因的轉(zhuǎn)錄。(4)低氧條件下,海月水母細(xì)

9、胞內(nèi)存在依賴于乳酸脫氫酶的無氧代謝過程。LDH基因的相對(duì)表達(dá)量和乳酸的含量隨著低氧培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,說明乳酸脫氫酶催化的可逆反應(yīng)正在向乳酸方向進(jìn)行。
　　5、提出海月水母耐受并適應(yīng)低氧環(huán)境的分子機(jī)制是脯氨酸羥基化酶-低氧誘導(dǎo)因子氧感受體系調(diào)控下的有氧代謝向無氧代謝的轉(zhuǎn)換
　　在低氧條件下,轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α受低氧誘導(dǎo)表達(dá)并迅速結(jié)合到糖酵解各個(gè)關(guān)鍵酶基因(如ALDO和PDK)的增強(qiáng)子區(qū)域,誘導(dǎo)靶基因的增強(qiáng)表達(dá),通過加速

10、糖酵解提供的能量來維持海月水母的生理功能。轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α進(jìn)一步通過誘導(dǎo) LDH基因的表達(dá)將在細(xì)胞內(nèi)由于糖酵解加速而累積的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸,最終實(shí)現(xiàn)有氧代謝向無氧代謝的轉(zhuǎn)換。
　　6、提出低氧條件下海月水母轉(zhuǎn)錄因子HIF蛋白的大量表達(dá)可能是轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平共同作用的結(jié)果
　　直接證實(shí)了HIF-1α在海月水母中存在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。而對(duì)HIF-1α進(jìn)行蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域的分析則發(fā)現(xiàn),海月水母HIF-1α含有氧依賴降解區(qū)(