蘿卜鉛(Pb)脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制研究.pdf

1、重金屬污染嚴(yán)重影響蔬菜作物產(chǎn)量與品質(zhì)，通過(guò)食物鏈會(huì)嚴(yán)重威脅人類健康。鉛(Pb)是最有毒的重金屬之一，容易被植物所吸收、并在不同的部位積累。蘿卜(Raphanus sativus L.)是一種主要以膨大的肉質(zhì)根為食用器官的蔬菜作物，其肉質(zhì)根容易受到Pb等重金屬的影響，因此研究蘿卜對(duì)重金屬的脅迫響應(yīng)機(jī)制和遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯得極為重要。前人在蘿卜Pb吸收累積、轉(zhuǎn)運(yùn)和脅迫響應(yīng)生理生化變化等方面已進(jìn)行相關(guān)研究，但對(duì)蘿卜Pb脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制尚不清楚。

2、鑒定出蘿卜Pb脅迫響應(yīng)的功能基因、蛋白或代謝物是闡明其脅迫響應(yīng)分子機(jī)制的重要基礎(chǔ)。本研究以蘿卜高代自交系‘NAU-RG’為試材，采用基于新一代測(cè)序技術(shù)的RNA測(cè)序(RNA-seq)對(duì)蘿卜肉質(zhì)根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組de novo測(cè)序，并且從轉(zhuǎn)錄組、蛋白組與代謝組水平等方面系統(tǒng)研究蘿卜重金屬Pb脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.為了獲得較為全面的蘿卜肉質(zhì)根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用Solexa Illumina平臺(tái)對(duì)不同發(fā)育階段（包括幼苗期

3、、破肚期和成熟期）的肉質(zhì)根進(jìn)行混樣，構(gòu)建了一個(gè)cDNA文庫(kù)(‘CKA’)進(jìn)行雙末端測(cè)序。共獲得約66.11M clean reads數(shù)據(jù)，通過(guò)拼接得到73，084條unigenes，其中N50為1，095 bp，總長(zhǎng)度為55.73 Mb。對(duì)所得到的unigenes與NCBInon-redundant(NR)、Gene Ontology(GO)、Clusters of Orthologous Group(COG)和Kyoto Encycl

4、opedia of Genes and Genomes(KEGG)等公共蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì)，共有67，305條unigenes(占總數(shù)92.09％)得到了功能注釋。這些unigenes主要參與基本生理和代謝過(guò)程，次生代謝物的生物合成途徑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和其它一些與細(xì)胞成分、分子功能相關(guān)的過(guò)程。所獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為研究蘿卜肉質(zhì)根中相關(guān)性狀形成的分子機(jī)理和特定響應(yīng)過(guò)程中關(guān)鍵基因分離鑒定提供了重要信息基礎(chǔ)。
　　2.為了在mRNA水平上

5、分離鑒定Pb脅迫響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中差異表達(dá)基因，通過(guò)構(gòu)建對(duì)照組(CK)和處理組(Pb1000)蘿卜肉質(zhì)根RNA文庫(kù)，利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行了蘿卜Pb脅迫響應(yīng)的差異基因表達(dá)譜分析。共獲得4，614個(gè)顯著的差異表達(dá)基因(DEGs)，包括2，154個(gè)上調(diào)表達(dá)和2，460個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。GO和pathway富集分析表明，Pb脅迫上調(diào)表達(dá)的差異基因主要參與細(xì)胞壁的防御響應(yīng)、谷胱甘肽代謝相關(guān)的生化過(guò)程，而下調(diào)表達(dá)的差異基因則主要參與碳水化合物代謝相關(guān)途徑。

6、利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)22個(gè)差異基因進(jìn)行表達(dá)模式驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與RNA-seq分析結(jié)果高度一致。此外，成功鑒定出多個(gè)參與防御和解毒機(jī)制的候選基因，包括編碼信號(hào)感知轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子、金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及合成螯合物相關(guān)酶的基因。
　　3.為系統(tǒng)分離鑒定蘿卜肉質(zhì)根中Pb脅迫響應(yīng)的miRNA及其靶基因，構(gòu)建了對(duì)照組(CK)和處理組(Pb500)蘿卜肉質(zhì)根sRNA文庫(kù)。通過(guò)應(yīng)用Solexa測(cè)序共鑒定到74個(gè)已知miRNA和173個(gè)新型miRN

7、A。其中，有25個(gè)已知的和9個(gè)新型miRNA被鑒定為Pb脅迫響應(yīng)miRNA?；谔}卜參考基因組序列的降解組分析，共得到1，979個(gè)miRNA-mRNA靶向轉(zhuǎn)錄本。GO分析表明，這些靶向轉(zhuǎn)錄本主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、防御響應(yīng)和與結(jié)合有關(guān)的過(guò)程。同時(shí)鑒定的Pb脅迫響應(yīng)miRNA的靶基因主要參與逆境相關(guān)的信號(hào)感知、轉(zhuǎn)導(dǎo)和相關(guān)次級(jí)代謝途徑，及與金屬離子吸收和體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，包括激活多種金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和調(diào)節(jié)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。
　　4.運(yùn)用蛋白組學(xué)iTR

8、AQ技術(shù)對(duì)Pb500和Pb1000脅迫下蘿卜肉質(zhì)根蛋白質(zhì)組變化進(jìn)行分析。在95％的置信區(qū)間內(nèi)共鑒定到3，898個(gè)蛋白，對(duì)2，141個(gè)蛋白進(jìn)行定量分析。2種Pb處理的差異蛋白有部分重疊，共有721個(gè)蛋白在至少一種Pb脅迫處理中差異表達(dá)，135個(gè)蛋白在Pb500與Pb1000處理下均顯示差異表達(dá)。GO和pathway富集分析表明，135個(gè)共同差異表達(dá)蛋白主要參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分變化、碳水化合物和能量代謝相關(guān)的代謝途徑和抗氧化防御。此外，將蘿卜P

9、b脅迫下蛋白水平與轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，有77.3％可鑒定蛋白和和77.9％的可定量蛋白在轉(zhuǎn)錄水平被關(guān)聯(lián)到，但其表達(dá)豐度變化卻呈現(xiàn)出極低的相關(guān)性。
　　5.應(yīng)用GC-MS技術(shù)對(duì)Pb脅迫下蘿卜肉質(zhì)根的代謝物組分進(jìn)行分析。對(duì)照組(CK)和處理組(Pb1000)在主成分分析(PCA)和偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)中均可明顯區(qū)分，采用PLS-DA模型第一主成分的VIP(Variable Importance in the