丁酸鹽減少IL-10基因敲除小鼠致腸炎的IgA包裹性細(xì)菌及改善腸道菌群結(jié)構(gòu).pdf

1、炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種病變可涉及整個(gè)消化道的病因不明的慢性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，病變主要累及末端回腸和結(jié)腸。盡管IBD的病因尚未明確，但普遍認(rèn)為腸道內(nèi)菌群失調(diào)是IBD重要的發(fā)病機(jī)制之一。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，菌群的培養(yǎng)及分析的方法日益先進(jìn)，使人類對(duì)于腸道菌群的分析也更加精確，從而為人類對(duì)微生物的進(jìn)一步了解打下堅(jiān)定的基礎(chǔ)。而近年出現(xiàn)的分析細(xì)菌的16S rRN

2、A序列已經(jīng)成為細(xì)菌菌種鑒定方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”。16S rRNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中。16S rRNA具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長(zhǎng)（包含約50個(gè)功能域）。隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)及核酸研究技術(shù)的不斷完善，16S rRNA基因檢測(cè)技術(shù)已成為病原菌檢測(cè)和鑒定的一種強(qiáng)有力工具。數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，應(yīng)用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌進(jìn)行快速、微量、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便地分類鑒定和檢測(cè)。
　　目前的研究發(fā)現(xiàn)

3、，IBD患者或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)小鼠模型的腸道的菌群結(jié)構(gòu)往往表現(xiàn)為菌群紊亂和生物多樣性的減少，如腸道內(nèi)厚壁菌門細(xì)菌和柔嫩梭菌比例比正常健康人群的細(xì)菌的比例低，而擬桿菌門細(xì)菌和腸桿菌科細(xì)菌的比例比正常人群的比例是有所增加的;更有發(fā)現(xiàn)某些特定的細(xì)菌可以使腸道的腸炎或結(jié)腸炎加重，如普雷沃什菌屬和螺桿菌屬，但是這卻并不具有普遍性的特點(diǎn)，往往個(gè)體性差異較大，將這種結(jié)果應(yīng)用到其他個(gè)體是不太相同，甚至是相反的。因此，這種具體到某種細(xì)菌的結(jié)果又無(wú)法揭示炎癥性腸病

4、的病因。
　　直至近期，有研究發(fā)現(xiàn)存在一類細(xì)菌可與免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)結(jié)合并且被包裹，實(shí)驗(yàn)將IBD患者的糞便中篩選并培養(yǎng)出這一類細(xì)菌，這種能夠被IgA包裹的細(xì)菌經(jīng)過(guò)灌胃后能夠使DSS誘導(dǎo)的無(wú)菌小鼠的結(jié)腸炎癥加重，而若是選用不能被IgA包裹的細(xì)菌灌胃后的這種小鼠卻沒(méi)有炎癥加重的現(xiàn)象。因此，這類被IgA包裹的細(xì)菌可能是導(dǎo)致炎癥性腸病的致病性細(xì)菌。IgA是一類主要在黏膜表面分泌且能與腸道微生物的片段結(jié)

5、合的一類抗體。IgA能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力來(lái)抵抗腸道中的病原體，如病毒、細(xì)菌和毒素，也能對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)起到維持作用，研究發(fā)現(xiàn)缺乏IgA分泌的人類和小鼠更加容易患有IBD、乳糜瀉和過(guò)敏性疾病。IgA還通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體共生菌群的組成、基因表達(dá)和菌群動(dòng)力等作用來(lái)影響宿主腸上皮細(xì)胞的生理功能和免疫功能。由此可知，尋找可以減少IgA包裹性細(xì)菌的方法可能是作為治療IBD的一個(gè)有效手段。
　　飲食被認(rèn)為是影響腸道菌群最重要的因素之一，故越來(lái)越多的研究想要

6、尋找出是否存在某些物質(zhì)或方法能夠使受到破壞的菌群結(jié)構(gòu)重新建立，從而恢復(fù)機(jī)體正常菌群結(jié)構(gòu)和保證機(jī)體健康。近些年來(lái)，新的方法不斷涌現(xiàn)，如糞菌移植，這是通過(guò)將健康人群的糞便細(xì)菌移植給一些菌群結(jié)構(gòu)紊亂的患者中來(lái)治療患者的疾病的方法。此外，膳食纖維、益生元和益生菌也越來(lái)越受到人群和醫(yī)療結(jié)構(gòu)的青睞，不僅作為健康產(chǎn)品，同時(shí)研究中的應(yīng)用也更加廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，可溶性膳食纖維在IBD患者和動(dòng)物模型中對(duì)于腸炎具有抗炎的作用，但背后的機(jī)制卻尚不明確。我們知道，

7、可溶性膳食纖維在結(jié)腸細(xì)菌的作用下可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。短鏈脂肪酸對(duì)于維持結(jié)腸的正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能具有重要作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在IBD患者及動(dòng)物模型中產(chǎn)丁酸菌的數(shù)量與正常人群相比有明顯降低，同時(shí)伴隨著丁酸代謝和產(chǎn)量的減少。短鏈脂肪酸特別是丁酸可以通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)腸調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫功能起到抗結(jié)腸炎的作用。那么，丁酸能否對(duì)腸道菌群產(chǎn)生影響呢？從以上的研究和數(shù)據(jù)中我們可以發(fā)現(xiàn)丁酸確實(shí)是對(duì)腸道的炎癥、正常功能、

8、能量提供和免疫功能等產(chǎn)生影響的，但是產(chǎn)生這些影響的背后機(jī)制，特別是對(duì)腸道菌群的影響的具體研究卻是不多的。丁酸是否對(duì)于腸道的細(xì)菌的結(jié)構(gòu)組成和生物多樣性產(chǎn)生作用，是否因此對(duì)產(chǎn)丁酸的菌群以及其他益生菌有影響，這些我們都不知道。本課題進(jìn)行研究的初衷就是基于以上這些原因才產(chǎn)生的，希望能夠解答部分我們尚不知道的現(xiàn)象的原因。
　　目的：假設(shè)丁酸鹽可能通過(guò)影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)以及減少腸道內(nèi)致腸炎的IgA包裹性的細(xì)菌來(lái)減輕IBD動(dòng)物模型IL-10基因

9、敲除小鼠的炎癥。
　　方法:我們選取8周齡的野生型C57BL/6小鼠4只及同樣周齡的IL-10基因敲除小鼠8只，將IL-10基因敲除小鼠隨機(jī)分成兩組，每組各4只。實(shí)驗(yàn)組的IL-10基因敲除小鼠每天予喂食丁酸鹽(100mM)的水溶液;無(wú)干預(yù)措施組的IL-10基因敲除小鼠和空白對(duì)照組野生型小鼠均予喂食普通飲用水。在相同的飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)4周后處死并立即取結(jié)腸組織和結(jié)腸糞便進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。取各組小鼠的結(jié)腸組織用蘇木精-伊紅染色法染色以及免

10、疫熒光方法觀察結(jié)腸組織的炎癥，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)炎癥因子白介素(interleukin，IL)-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-a的mRNA基因的相對(duì)表達(dá)來(lái)測(cè)定炎癥因子的表達(dá)水平;取各組小鼠的結(jié)腸糞便采用氣相色譜分析方法測(cè)定小鼠結(jié)腸糞便中短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）的含量;采用16S rRNA基因測(cè)序的方法對(duì)各組小鼠結(jié)腸糞便的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;選用流式細(xì)胞術(shù)的方法對(duì)各組小鼠結(jié)腸糞便中Ig

11、A包裹性細(xì)菌的含量進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:給予喂食丁酸鹽后的IL-10基因敲除小鼠的結(jié)腸組織炎癥比IL-10基因敲除小鼠無(wú)干預(yù)措施組的炎癥程度明顯減輕，同時(shí)結(jié)腸炎癥評(píng)分也明顯降低(1.25±0.50 vs.2.5±0.58分，p=0.025);炎癥指標(biāo)IL-6和TNF-a表達(dá)水平在喂食丁酸鹽的IL-10基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)組也明顯下降(分別9.71±1.15vs.12.92±1.64, p=0.006;8.17±0.79 vs.11.1

12、7±1.45, p=0.002)，和野生型小鼠對(duì)照組間卻沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（分別是p=0.388;p=0.285）;還有伴隨著小鼠結(jié)腸CD4+淋巴細(xì)胞數(shù)目的減低(14.00±2.94 vs.3.50±1.29，p＜0.001)。IL-10基因敲除小鼠無(wú)干預(yù)措施組和喂食丁酸鹽的IL-10基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)組的糞便中的乙酸、丙酸和丁酸的含量明顯比野生型小鼠空白對(duì)照組的含量顯著增加（分別是乙酸:3.48±0.27 vs.0.76±0.16 ug/m

13、g，p＜0.001以及2.72±0.42 vs.0.76±0.16 ug/mg, p＜0.001;丙酸:0.78±0.18 vs.0.25±0.04 ug/mg, p=0.001以及0.75±0.17 vs.0.25±0.04 ug/mg，p=0.001;丁酸:1.57±0.60 vs.0.18±0.06 ug/mg, p=0.044和1.26±0.46 vs.0.18±0.06 ug/mg, p=0.042)。而IL-10基因敲除小鼠

14、無(wú)干預(yù)措施組糞便中的短鏈脂肪酸僅乙酸含量與喂食丁酸鹽的IL-10基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(3.48±0.27 vs.2.72±0.42 ug/mg，p=0.006)，而丙酸及丁酸的含量卻沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（分別是p=0.800和p=0.792）。菌群分析發(fā)現(xiàn)在門的水平上，在喂食丁酸鹽的IL-10基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)組中厚壁菌門的細(xì)菌的含量比IL-10基因敲除小鼠無(wú)干預(yù)措施組卻有了明顯地增加(32.86±1.47 vs.12.68±10.6

15、2％; p=0.012)，擬桿菌門細(xì)菌的含量下降(62.76±2.38 vs.81.07±13.51％，p=0.046)。在科的水平上，喂食丁酸鹽后的IL-10基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)組的乳酸桿菌科及Erysipelotrichaceae細(xì)菌含量卻升高了，雖然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別是6.69±6.75 vs.0.98±0.42％，p=0.132和12.87±11.27 vs.2.38±2.65％，p=0.155)。在屬的水平上，喂食丁酸鹽后的IL-

16、10基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)組的普雷沃什菌屬的細(xì)菌含量卻比無(wú)干預(yù)措施組小鼠的含量明顯降低了，雖然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(18.79±16.18 vs.31.68±19.23％，p=0.219)。另外，喂食丁酸鹽后的IL-10基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)組的物種豐富度比IL-10基因敲除小鼠無(wú)干預(yù)措施組高（shannon指數(shù):3.22±0.29 vs.2.91±0.74，p=441;simpson指數(shù):0.09±0.02 vs.0.17±0.11，p=0.175），雖

17、然均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。最后，IL-10基因敲除小鼠無(wú)干預(yù)措施組糞便中IgA包裹性細(xì)菌的含量比野生型小鼠和喂食丁酸鹽后的IL-10基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)組的含量均明顯升高（分別是80.5±12.10 vs.54.8±2.12％, p=0.001和80.5±12.10 vs.44.7±0.92％,p＜0.001)，而野生型小鼠和喂食丁酸鹽后的IL-10基因敲除小鼠的糞便中IgA包裹性細(xì)菌的含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:IL-10基因敲除小鼠喂食